Crecimiento y Multiplicacin Bacteriana

I. VISION GLOBAL DEL CRECIMIENTO CELULAR La clula bacteriana es capaz de duplicarse a s misma. Para el crecimiento de la clula bacteriana son necesarios no menos de 2000 reacciones bioqumicas de biosntesis, dentro de las cuales las mas importantes son las reacciones de polimerizacin (sntesis de ADN, ARN y protenas). Una vez que los polmeros estn fabricados, se puede decir que est dispuesto el escenario para los acontecimientos finales del crecimiento celular.

Divisin Bacteriana

II. CRECIMIENTO DE POBLACIONES

Crecimiento se define como aumento en el numero de clulas

microbianas en una poblacin, lo cual tambin puede ser medido como un incremento en la masa microbiana.

Velocidad de crecimiento es el cambio en el numero de clulas o masa celular por unidad de tiempo.

Tiempo de generacin o de duplicacin. Tiempo requerido para

que a partir de una clula se formen dos clulas. El tiempo de generacin varia de un microorganismo a otro.

Crecimiento exponencial
Se llama crecimiento exponencial al incremento de la poblacin bacteriana en el que el nmero de clulas se dobla cada cierto periodo de tiempo.
tiempo (hr) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 . . . 10 numero total de clulas 1 2 4 8 16 32 64 128 . . . 1,048,576

CULTIVO DISCONTINUO:

Llamado

tambin sistema cerrado. Los microorganismos se incuban en un recipiente cerrado con medio lquido al que no se aade ms cantidad de medio que el inicial, en consecuencia, las concentraciones de nutrientes disminuyen y los residuos aumentan.

Requerimientos para el Crecimiento

A. Requerimientos Fsicos: Incluyen

Temperatura, el pH, Presin osmtica. B. Requerimientos Qumicos: Incluyen fuentes de carbono, nitrgeno, azufre, fsforo, oligoelementos, oxgeno y factores de crecimiento.

Temperatura
Las bacterias se dividen en 3 categoras:
A) Sicrfilos (afinidad por el fro) B) Mesfilos (afinidad por T moderada)

C) Termfilos (afinidad por el calor).

T mnima de crecimiento: Es la T mas baja en

la cual crecer la especie. T ptima de crecimiento: Es la T a la cual la especie crece mejor. T mxima de crecimiento: Es la T mas alta a la cual es posible el crecimiento

Presin Osmtica
Casi todos los nutrientes que requieren las

bacterias se encuentran disueltos en el agua circundante. Cuando la PO es elevada tiende a eliminar agua de la clula (plasmlisis), esto sucede cuando el m.o, se encuentra en un medio hipertnico (Halfilos, Osmfilos)

pH
Se refiere a la acidez o alcalinidad de una

solucin. La mayora de las bacterias crecen mejor en un rango cercano a la neutralidad (6,5 7,5). Cuando las bacterias crecen en los medios de cultivo a menudo producen cidos que al final interfieren con su crecimiento, esto se corrige agregando al medio sustancias qumicas que actan como tampones o buffers.

Oxgeno
Los m.o que utilizan el oxgeno molecular

producen mas energa a partir de los nutrientes que los que no lo utilizan. Los m.o se dividen segn la necesidad de Oxgeno: A) Aerobios estrictos. B) Anaerobios facultativos. C) Anaerobios estrictos. D) Anaerobios aerotolerantes. E) Microaerfilos

Jarra de Brewer

III. CICLO DE CRECIMIENTO POBLACIONAL

En un recipiente cerrado conocido como cultivo en batch, o en medio no renovado la curva de crecimiento se divide en: Fase de latencia Fase exponencial

Fase estacionaria
Fase de muerte

Fase de Latencia
Aunque no hay divisin celular ni crecimiento de

masa, la clula esta sintetizando nuevos componentes macromoleculares, de la actividad metablica y de la susceptibilidad a los componentes qumicos y fsicos. La fase de latencia es un periodo de ajuste necesario para el reabastecimiento del pool celular de metabolitos a un nivel compatible a la sntesis celular mxima.

Una fase de latencia previa al comienzo de la divisin celular puede ser necesaria por diversas razones: Las clulas pueden ser viejas y poseer una cantidad reducida de ATP, cofactores esenciales y ribosomas; estas sustancias deben sintetizarse antes del crecimiento. El medio puede ser diferente al anterior donde crecan los microorganismos. En este caso necesitarn nuevas enzimas para usar otros nutrientes. Los microorganismos pudieron ser alterados y necesitan un tiempo de recuperacin. La duracin de la fase de latencia varia, y segn la condicin de los microorganismos y la naturaleza del medio. Puede ser bastante larga si el inculo procede de un cultivo viejo o de uno que haya sido refrigerado.

Fase exponencial
Cuando una clula se divide en dos, estas en otras dos y as sucesivamente.
La mayora de los microorganismos unicelulares crecen exponencialmente, pero las velocidades de crecimiento exponencial puede variar. En esta fase los microorganismos crecen y se dividen hasta el nivel mximo, en funcin de su potencial gentico, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. La velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; es decir los microorganismos se dividen y duplican en nmero a intervalos regulares.

Fase estacionaria
En esta fase el crecimiento de la poblacin cesa y la curva de crecimiento se vuelve horizontal. Las bacterias llegan a esta fase cuando el nivel de la poblacin es de aproximadamente de 109 clulas por ml. Otros microorganismos como los protozoos y algas llegan a una concentracin de 106 clulas por ml. No hay incremento neto (o decremento) del numero de clulas. Durante esta fase en algunos organismos tiene lugar el crecimiento crptico. Implicancia de los genes sur (por survival = supervivencia ), necesarios para la supervivencia celular durante la fase estacionaria.

 Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria

por varias rezones: Un factor es la limitacin de nutrientes, Si se reduce intensamente la concentracin de un nutriente esencial, la poblacin crecer lentamente. Por ejemplo los organismos aerobios estn limitados a menudo por la disponibilidad de O2. El crecimiento de una poblacin puede tambin cesar debido a la acumulacin de residuos txicos. Este factor limita el crecimiento de cultivos anaerobios. En la fase estacionaria el nmero total de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser resultado del equilibrio entre la divisin y la muerte de las clulas, o simplemente porque la poblacin deja de dividirse, aunque siga su actividad metablica.

Fase de muerte

Si la incubacin continua despus que la poblacin alcance la fase estacionaria, las clulas deben permanecer vivas y metablicamente activas, pero tambin deben morir. Si esto ltimo ocurre se dice que las clulas entran en fase de muerte.

CURVA TPICA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO EN UN CULTIVO EN BATCH, O EN MEDIO NO RENOVADO

IV. MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

El crecimiento de una poblacin microbiana se mide siguiendo los cambios en el numero de clulas o el peso de la biomasa celular.

A)Mtodos Directos de la Masa celular

Determinacin del Peso Hmedo Determinacin del Peso Seco

B) Mtodos Indirectos
Nefelometra o Turbiometra Recuento de Clulas Viables

MTODOS DIRECTOS
DETERMINACIN DEL PESO HMEDO: se tara un tubo de centrfuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el

sobrenadante. se determina el peso del sedimento. Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

 DETERMINACIN DEL PESO SECO: Como el anterior, pero el sedimento se seca

antes de ser pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo. Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5 x 10 9 bacterias.

MTODOS INDIRECTOS
MTODOS TURBIDIMTRICOS (PTICOS). Son muy usados en la prctica cotidiana del

laboratorio. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.

NEFELOMETRA O TURBIDIOMETRA
Este mtodo implica un estudio comparativo entre el cultivo celular y una solucin de bicloruro de Bario en solucin de cido sulfrico, esta solucin se le conoce como nefelmetro de Macfarland.

ESPECTROFOTMETRO:
Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio

de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a travs de la supensin). Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema. Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta pues a longitudes de onda (l) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ml.

Espectrofotmetro en medida del crecimiento

MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS.

MTODOS DIRECTOS
CMARA DE RECUENTO DE PETROFF-HAUSER:

Consiste en un portaobjetos especial con una

graduacin en superficie y unas medidas muy concretas: Excavacin con 0.02 mm de profundidad. rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes. Cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeos. Es decir, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeos).

Contaje Microscpico Directo Utilizando la Cmara Petroff - Hausser

Limitaciones del Contaje Microscpico Directo 1. Las clulas muertas no se distinguen de la vivas. 2. Las clulas pequeas son difcil de ver al microscopio y algunas de ella probablemente no se cuentan. 3. Se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisin por este mtodo.

4. Se requiere de un microscopio de contraste de fases cuando la muestra no esta teida.

5. Este mtodo no es bueno para una suspensin de clulas poco densas.

CONTADORES ELECTRNICOS DE PARTCULAS (TIPO COULTER):

Se hace pasar una suspensin microbiana por un tubo

capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula). Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partculas extraas (las pequeas seran contabilizadas errneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato).

RECUENTO DE CELULAS VIABLES

Una clula viable se define como la que es capaz de dividirse para dar lugar a descendencia y la forma habitual de llevar a cabo un contaje de este tipo, es determinado en nmero de clulas capaces de generar colonias sobre la superficie de un medio slido.
El mtodo de siembra puede ser: Siembra por extensin Por vertido en placa

SIEMBRA POR EXTENSIN

SIEMBRA POR VERTIDO EN PLACA

FUENTE DE ERROR EN EL MTODO DE CONTAJE EN PLACA

Las clulas depositadas sobre el medio de cultivo no desarrollarn colonias al mismo tiempo, de modo que si en tiempo de incubacin es corto se obtendr un numero ms bajo de lo real. Es normal el determinar las condiciones de incubacin (medio, temperatura y tiempo), que darn el nmero mximo de colonias para un organismo dado y a partir y ah utilizar siempre las mismas condiciones. El contaje de viables puede ser fuente de errores muy grandes de modo que hay que tomar muchas precauciones y replicar las placas de las diluciones claves.

A menudo se expresan comunidades formadoras de colonias en lugar de clulas viables.

DILUCIONES
Para obtener el nmero de colonias apropiado la muestra debe ser casi siempre diluida, necesariamente es necesario hacer ms de una dilucin, generalmente seriadas en base 10.

Para hacer una dilucin de 10 veces uno puede mezclar 0,5 ml de muestra con 4,5 de diluyente, o 1,0 de muestra con 9,0 de diluyente.

En la mayora de las ocasiones hay que realizar tales diluciones seriadas para que el numero de colonias sea el deseado. Por tanto, si se necesita una dilucin de un milln de veces se puede conseguir por tres seriadas de 100 veces, o por seis seriadas de 10 veces.

Mtodo del Nmero Mas Probable

Es una estimacin estadstica, basada en el

hecho de que cuanto mayor sea el nmero de bacterias en una muestra, mayor ser la dilucin necesaria para reducir la densidad hasta el punto en el cual no se desarrolle ningn m.o, en los tubos de una serie de diluciones.

Nmero Mas Probable (NMP)

Tabla del NMP (Serie de tres tubos)

Recuento sobre Filtros

Se usa para suspensiones diluidas de bacterias.

Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

Recuento sobre Filtros

VI. CULTIVO CONTINUO

Es un sistema abierto de cultivo de microorganismos en el que se mantienen las condiciones ambientales constantes a travs de un suministro continuo de nutrientes y de la retirada de residuos. En este tipo de cultivo se puede mantener una poblacin microbiana en fase de crecimiento exponencial, a una concentracin constante de biomasa durante un periodo largo de tiempo. Una vez que se alcanza el equilibrio, el nmero de clulas y el estado metablico se mantienen constantes, se dice entonces que se alcanza el Estado de Equilibrio.

EL QUIMIOSTATO
Es el tipo mas comn de cultivo continuo, que permite el control de

la densidad de la poblacin y la velocidad de crecimiento del cultivo.

Consta de un recipiente de cultivo que se alimenta con un medio

estril a la misma velocidad con que se gasta el medio que contiene los microorganismos.
En el control del quimiostato se utilizan dos elementos: La velocidad

de Dilucin y la Concentracin de un Nutriente Limitante (tales como la fuente de carbono o nitrgeno).

 Debido a la presencia del nutriente limitante la velocidad del

crecimiento se determina por la velocidad a la que se incorpora ms cantidad de medio en la cmara de cultivo y la densidad final celular depende de las concentraciones del nutriente limitante. La velocidad de dilucin es la velocidad de recambio del nutriente, velocidad a la que el medio fluye en el recipiente de cultivo, respecto del volumen del mismo: D=f V D= Velocidad de Dilucin f= velocidad de flujo (mL/h) V= volumen del recipiente (mL)

Sistema de cultivo continuo al que se le renuevan los nutrientes y retiran los residuos. Las condiciones ambientales se mantienen constantes

VII. CRECIMIENTO EQUILIBRADO Y DESEQUILIBRADO

El crecimiento exponencial, tanto en cultivos discontinuos como continuos, es un crecimiento equilibrado. Es equilibrado cuando todos los componentes celulares se forman a una velocidad constante. Si se modifican las concentraciones de nutrientes y otras condiciones ambientales, se origina un crecimiento desequilibrado. Se produce un crecimiento desequilibrado cuando: . Si se transfieren bacterias desde un medio pobre en a otro ms rico. . Si pasa una poblacin bacteriana de un medio rico en a otro ms pobre. nutrientes

nutrientes