PRACTICA DE LABORATORIO

MICROBIOLOGÍA
TECNICA DE LOS TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACIÓN PRUEBA
NORMALIZADA – SIMULACRO

Carolina Agudelo
Bryan Terán
Angee Muñoz
https://www.youtube.com/watch?v=WtwLOSmbaG8&t=69s

FUNDAMENTO
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces
de desarrollarse extra intestinalmente. El grupo coliforme es constante, abundante
y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las características de
sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se
observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como
indicador de contaminación fecal en agua; conforme mayor sea el número de
coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una
contaminación reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo
sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme
adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios
que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.),
se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias. Los microorganismos
coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente
intestinal para la mayoría de las especies que involucra. El grupo de bacterias
coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción
de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC.

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del

Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a
35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.

SIMULACRO:

El proceso a seguir es la simulación de practica de laboratorio, que nos ayudara

como estudiantes a afianzar el conocimiento obtenido en clase, pues como futuros
ingenieros de alimentos debemos tener muy claro el concepto, pues es de vital
importancia para definir la calidad del agua usada en los procesos, o para
evidenciar malas prácticas sanitarias durante los diferentes procesos de los
mismos.

Hoy, 13 de abril del año 2021ª las 9:00 a.m, al laboratorio (X) ha llegado
una muestra de leche, proveniente de una procesadora que se dedica a
maquilar para las diferentes empresas de este sector; uno de sus clientes,
desea conocer la inocuidad de el alimento que esta adquiriendo, el cual
posteriormente distribuirá al cliente final (los hogares colombianos).

Iniciamos con la fase presuntiva, para la determinación de la presencia de

coliformes en la leche; así:

1. Se pesan 10 gr de muestra (leche).

2. Se pasan a un matraz y se adicionan 90 ml de diluyente (agua
peptonada al 0,1%).
3. Realizar dos diluciones (1/10) y otra (1/100), con un ml de
muestra(diluida), en 9 ml de solución diluyente.
4. De cada dilución anterior, (10-1, 10 -2, 10-3) sembrar 3 tubos de cada una,
usando 1 ml de cultivo, en 9 ml de caldo lauril sulfato de sodio.
5. Y procedemos a la incubación a 35°C, durante 24 a 48 horas.
6. Pasadas 24 a 48 horas, se procede a revisar y evidenciar los tubos que
presenten formación de gas o turbidez.
7. Con los tubos que presentan turbidez se procede a una segunda
incubación a 35°C, por 24 horas más.
 14 de abril 2021:

2:15 pm: Se procede a revisar los tubos que han pasado 29 horas en incubación,
encontrándose los siguientes resultados.
De los tres tubos incubados a concentración (10 -1):
1. Se evidencia presencia de aire
2. Se evidencia presencia de aire
3. Se evidencia turbidez.

De los tres tubos incubados a concentración (10 -2):

1. Se evidencia presencia de aire
2. Se evidencia turbidez
3. Se evidencia presencia de aire

De los tres tubos incubados a concentración (10 -3):

1. Se evidencia turbidez.
 2. Se evidencia presencia de aire.
3. Se evidencia turbidez.

Como segundo paso en la prueba presuntiva, se procede a incubar por 24

horas más aquellos tubos que presentaron turbidez:

1. El tubo No. 3 de la concentración 10-1

2. El tubo No. 2 de la concentración 10-2
3. Los tubos No. 1 y 3 de la concentración 10 -3

 PRUEBA DE CONFIRMACIÓN - SIMULACRO

La prueba confirmativa es un procedimiento mediante el cual, una reacción

negativa excluye la presencia del grupo coliforme, mientras que una reacción
positiva indica su presencia inequívoca. Deben someterse a esta prueba todos los
tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva.

En la continuación de nuestra práctica, para determinar la presencia de coliformes

por el método NMP, se procede a realizar la prueba confirmativa con los tubos
de ensayo que dieron resultados positivos en la prueba presuntiva.

Después de pasadas 29 horas de incubación, se obtienen los siguientes

resultados:

Tubos de ensayo con dilución 10-1

 Tubo #1: Positivo, presencia de gas y turbidez
Tubo #2: Positivo, presencia de gas y turbidez
Tubo #3: Negativo, turbidez

Tubos de ensayo con dilución 10-2

Tubo #1: Positivo, presencia de gas y turbidez
Tubo #2: Negativo, Turbidez
Tubo #3: Positivo, presencia de gas y turbidez

Tubos de ensayo con dilución 10-3

Tubo #1: Negativo, turbidez
Tubo #2: Positivo, presencia de gas y turbidez
Tubo #3: Negativo, turbidez
Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la

prueba presuntiva a otro tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde
brillante (brila), con campana de Durham.
• Agitar los tubos para su homogeneización.
• Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h.
• Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento
y producción de gas, después de un período de incubación de 24 a 48 h.
• Consultar las tablas de NMP.
Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la

prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con
caldo EC conteniendo campana de Durham.
• Agitar los tubos para su homogeneización.
• Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48
h.
• Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y
producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
• Consultar la tabla de NMP.

Una vez pasado el tiempo de incubación, procedemos a analizar los resultados de

la prueba confirmativa y, con ayuda de las tablas de NMP hallar los valores a cada
combinación que se obtenga
 Continuación prueba de coliformes (Día 3)
Continuación simulaciones de laboratorio para la determinación de NMP de
coliformes totales y fecales, por medio de tubos múltiples de fermentación:

Pasadas 30 horas de incubación de la prueba confirmativa, se procede a

analizar los tubos para determinar cuáles presentan positivo para coliformes
totales y fecales.

Para el caso de los tubos con el Caldo Lactosa verde brillante bilis, obtuvimos los
siguientes resultados:

De la dilución 10-1: Los dos tubos dieron positivo

De la dilución 10-2: Sólo uno de los tubos, dio positivo
De la dilución 10-3: En este no se obtuvo generación de gas, por lo que el
resultado fue negativo.
Para hallar el NMP nos ayudamos de la tabla que se presenta a continuación,
junto con la combinación de datos que obtuvimos, para este caso obtuvimos una
combinación 2-1-0.
En la tabla se puede apreciar que el NMP para una combinación 2-1-0 es de 6.8
NMP/100mL. Con un límite de confianza de 95%, en el cual el límite inferior es de
1,8 y el superior es de 17.

Para el caso de la prueba confirmativa de coliformes fecales, obtuvimos los

siguientes resultados:

Dilución 10-1: Dos tubos positivos

Dilución 10-2: Un tubo positivo
Dilución 10-3: Un tubo positivo

Al igual que en la prueba anterior para coliformes totales, aquí también

consultamos las tablas de NMP, en este caso para una combinación 2-1-1.

En la tabla anterior, se ilustra que el NMP para una combinación de 2-1-1 es: 9.2
NMP/100mL, con un límite de confianza de 95% en el cual el inferior es de 3.4 y el
límite superior es de 22.

 Por lo tanto, el laboratorio (x), determina que la muestra de leche analizada

se encuentra contaminada con heces fecales. Siendo así el laboratorio
rechaza la muestra catalogando como producto no apto para consumo
humano, el lote de leche completo debe rotularse como rechazado con
etiqueta color rojo, y se debe proceder al desecho del producto en su
totalidad.