BIOLOGÍA MOLECULAR

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
SÉPTIMO NIVEL

Patricio Orozco Freire

MSc Plant Genetic Manipulation

Septiembre 2017 – Febrero 2018

 REPARACIÓN DE ADN
 Las mutaciones pueden surgir de la incorporación de bases nitrogenadas
incorrectas durante la replicación del ADN

 También se producen por cambios espontáneos o como resultado de la

exposición a agentes químicos o radiación

 Este tipo de daños en el ADN pueden bloquear la replicación o la

transcripción, pudiendo dar lugar a una alta frecuencia de mutaciones, que
son inaceptables desde el punto de vista de la reproducción celular

 Para mantener la integridad de sus genomas, las células han tenido por tanto
que desarrollar mecanismos de reparación del ADN dañado
Mecanismos de reparación del ADN

 1.- Inversión directa de la reacción química responsable del daño al

ADN

 2.- Eliminación de las bases nitrogenadas dañadas seguida de su

reposición con ADN recién sintetizado
Inversión directa del ADN dañado
 Tan solo ciertos tipos de daños al ADN se reparan de esta forma, en
particular los dímeros de pirimidina que resultan de la exposición a la
luz UV y

 Los residuos de guanina alquilada que se han modificado por la adición

de grupos metilos y etilos en la posición O6 del anillo de purina

 La luz UV es una de las fuentes más importante de daño al ADN y su

importancia radica en que la mayoría de los cánceres de piel humanos
se deben a la exposición a esta
Luz UV
 El principal tipo de daño es la formación de dímeros de pirimidina

 En la que las pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN están

unidas por la formación de un anillo de ciclo butano que resulta de la
saturación de los dobles enlaces entre el carbono 5 y el 6

 Bloquea la replicación y la transcripción

 El proceso de la inversión directa de la reacción de dimerización es

conocido como fotorreactivación puesto que la energía derivada de la
luz visible se utiliza para romper el anillo ciclo butano
Es común en una variedad de
Células eucariotas y procariotas
Incluyendo: E. coli, levaduras y
algunas especies de plantas y
animales

Sin embargo, no es universal.

Mamíferos placentarios
incluyendo los humanos carecen
de este mecanismo de
reparación del ADN
Reacción entre agentes alquilantes y el ADN
 Los alquilantes son compuestos reactivos que son capaces de transferir
grupos metilo y etilo a una base de ADN, modificando por tanto la base.

 Por ejemplo, la metilación de la guanina en la posición O6, debido a que el

producto, O6-metilguanina, forma pares de bases complementarias con
timina en lugar de citosina.

 Esta lesión puede ser reparada por una enzima llamada O6-metil guanina
metiltransferasa, que transfiere el grupo metilo desde la O6-metilguanina al
sitio activo de un residuo de cisteína.

 Finalmente, restaurando la guanina original

 Esta enzima, se encuentra tanto en procariotas, eucariotas, incluyendo los

humanos.
Reparación por escisión
 Esta técnica abarca la reparación de una gran variedad de alteraciones
químicas en el ADN.

 En la reparación por escisión el ADN dañado es reconocido y

eliminado, como bases independientes o como nucleótidos

 El espacio generado se rellena con la síntesis de una nueva hebra de

ADN, utilizando la hebra complementaria como molde.

 1.- Reparación por escisión de una base

 2.- Reparación por escisión de un nucleótido
 3.- Reparación del desapareamiento
Reparación por escisión de bases
 La reparación de un ADN que contiene URACILO. Esta base dañada de
forma única es reconocida y eliminada de la molécula de ADN.

 El U puede surgir en el ADN de dos maneras: 1.- como dUTP

(desoxiuridina trifosfato) ocasionalmente en el lugar de la timina
durante la síntesis del ADN. 2.- por la desaminación de una citosina

 La escisión del U en el ADN está catalizada por la ADN glicosilasa una

enzima que rompe el enlace de unión de la base de U con el esqueleto
de desoxirribosa del ADN

 Esta reacción produce un U libre y un sitio apirimidínico (un azúcar sin

base)
ADN glicosilasa
 La enzima también reconoce y elimina otras bases anómalas:

 Incluyendo la hipoxantina formada por la desaminación de la adenina

 Purinas alquiladas distintas que la O6-alquilguanina y
 Bases dañadas por oxidación o radiación ionizante.

 El GAP que deja la enzima se conoce como sitio apurínico o apirimidínico ,

SITIO AP.

 Cada célula en el cuerpo humano se estima que pierde varios miles de bases
de purina diariamente.

 Estos sitios son reparados por la AP endonucleasa, que rompe de manera

adyacente al sitio AP. La desoxirribosa restante por lo tanto es eliminada y el
espacio de una sola base resultante es rellenado por la ADN polimerasa y
ligasa.
Reparación por escisión de nucleótidos

 Este sistema reconoce a una gran variedad de bases dañadas que

distorsionan a la molécula de ADN, incluyendo dímeros de pirimidina
inducidos por UV y grupos voluminosos añadidos a las bases de ADN
como resultado de la reacción de muchos carcinógenos con el ADN

 Se conoce así debido a que por ejemplo un dímero de timina es

eliminado como parte de un oligonucleótido que contiene la lesión
Escisión de nucleótidos y E. Coli
 En E. coli, la reparación es catalizada por los productos de tres genes
uvrA, uvrB y uvrC que fueron identificados debido a que las
mutaciones en estos loci resultan extremadamente sensibles a la UV

 La proteína UvrA reconoce al ADN dañado y recluta a la UvrB y UvrC al

sitio de la lesión.

 UvrB y UvrC rompen los extremos 3´ - 5´ del sitio dañado,

respectivamente, y por lo tanto escinden un oligonucleótido de 12 o
13 bases.

 El complejo UvrABC es conocido como escinucleasa, luego actúa la

helicasa que elimina el oligonucleótido, y el gap es llenado por la ADN
polimerasa I y la ligasa.
Escisión de nucleótidos, levaduras
y en humanos
 En levaduras se han identificado los genes RAD sensibles a la radiación

 En humanos se han identificado genes gracias al estudio de individuos

con enfermedades hereditarias que resultan de las deficiencias en ala
capacidad de reparar el ADN dañado.

 Por ejemplo la xeroderma pigmentosum (XP), que afecta a uno de cada

250.000 individuos. Desarrollan múltiples cánceres de piel.

 CONEXIÓN ENTRE LA REPACIÓN DE ADN Y EL CÁNCER

 Otras enfermedades estudiadas fueron el Síndrome de Cockayne y

tricotiodistrofia y además mutantes sensibles a UV procedentes de
líneas celulares de roedores
7 genes de reparación diferentes
 Designados desde XPA hasta XPG

 Las proteínas de mamíferos están muy relacionadas con los genes RAD de
levaduras, demostrando que se encuentra la función conservada en
eucariotas

 1.- Reconocimiento de alteraciones del emparejamiento de bases por parte

de XPC, seguida de la unión cooperativa de XPA, XPC y la proteína de unión al
ADN de hebra sencilla, RPA replication protein A y un factor de transcripción

 2.- XPC esta asociada con un factor de transcripción multisubunidades

denominado TFIIH, que es necesario para iniciar la transcripción de los genes
eucariotas

 3.- XPE también puede actuar reconociendo de lesiones

7 genes de reparación diferentes
 4.- Dos de las subunidades de TFIIG son las proteínas XPB y XPD, que actúan
como helicasas para desenrrollar aproximadamente 25 pb en torno a la zona
de lesión.

 5.- La XPG es reclutada al complejo seguido de XPF formando un

heterodímero con ERCC1 (una proteína de reparación identificada en células
de roedor sensibles al UV)

 6.- ERCC1/XPF1 y XPG, son endonucleasas que cortan el ADN en los extremos
5´ - 3´ de la región dañada, respectivamente.

 7.- Realizan un corte de un oligonucleótido de 30 bases

 8.- El gap es llenado por la ADN polimerasa δ en asociación con RFC y PCNA y
sellado mediante una ligasa
Reparación acoplada a la transcripción

 Reparación de lesiones en genes que son transcritos activamente

 Una conexión entre la transcripción y reparación fue descrita por

primera vez por experimentos que mostraban que las hebras de ADN
transcrito son reparadas más rápidamente que las hebras no
transcritas tanto en E. coli como en mamíferos

 Es una ventaja ya que la transcripción no puede proseguir si no se

repara la lesión
Tanto en E. coli como en mamíferos
 1.- Reconocimiento de la ARN polimerasa detenida en una lesión de la
hebra de ADN que se está transcribiendo

 2.- En E.coli, la ARN polimerasa es reconocida por una proteína

denominada factor de acoplamiento de la reparación a la
transcripción, que desplaza a la ARN polimerasa y recluta a la
escinoclueasa UvrABC a la zona de la lesión.

 3.- En mamíferos, la ARN polimerasa es reconocida por dos proteínas

CSA y CSB que están codificadas por los genes responsables del
síndrome de Cockayne (deficientes en la reparación acoplada a la
transcripción)

 4.- CSA y CSB reclutan a XPA, RPA y TFIIH hacia la lesión del ADN y se
produce una reparación por escisión de nucleótidos
Reparación no complementaria

 Es otro sistema de reparación por escisión que reconoce las bases no

complementarias que se incorporan durante la replicación del ADN.

 Muchas de estas bases no complementarias se eliminan por la

actividad de la doble lectura de la ADN polimerasa. Las que quedan
son reparadas por este sistema

 Las enzimas de este sistema de reparación son capaces de identificar y

escindir la base no complementaria, especialmente de la hebra recién
replicada
 En E. coli, el sistema de reparación puede distinguir la hebra de ADN parental
de la hebra de ADN recién replicada debido a que el ADN de esta bacteria se
modifica por la metilación de los residuos de adenina en la secuencia GATC
para formar 6-metiladenina.

 Puesto que la metilación se lleva a cabo después de la replicación, las hebras

de ADN recién sintetizadas no están metiladas, siendo fácilmente
identificables por el sistema de reparación

 1.- Enzima MutS reconoce la no complementariedad y forma un complejo con

MutL y MutH

 2.- La endonucleasa MutH rompe la hebra de ADN sin metilar en la secuencia

GATC

 3.- MutL y MutS actúan juntas con una endonucleasa y una helicasa para
escindir el ADN entre la brecha de la hebra y la no complementariedad

 4.- Finalmente, el espacio lo rellenarán la ADN polimerasa y la ligasa

 En células de mamíferos, la identificación es diferente, esta
determinada por la presencia de roturas en una sola hebra de ADN
recién replicado

 Los homólogos eucariotas de MutS y MutL se unen a la base no

apareada, donde dirigen la escisión

 La nueva hebra tardía recién sintetizada puede identificarse por la

presencia de roturas en ambos extremos de los fragmentos de
Okasaki, mientras que la hebra conductora se puede identificar por su
extremo 3´ en crecimiento
Importancia
 Mutaciones en los homólogos humanos de MutS y MutL son
responsables de un tipo de cáncer de colon hereditario (cáncer
colorrectal hereditario no poliposo o HNPCC)

 Afecta a uno de cada 200 individuos y es responsable del 15% de todos

los cánceres colorrectales en EE.UU.

 La relación entre el HNPCC y los defectos de reparación no

complementaria se descubrió en 1993, cuando se clono el gen
homólogo humano de MutS y se encontró que las mutaciones eran las
responsables de casi la mitad de todos los casos de HNPCC

 El resto de casos de cáncer fueron evidenciados por la mutación de

uno de los tres genes humanos que son homólogos a MutL
Síntesis de ADN translesión
 Los sistemas de reparación anteriormente mencionados actúan para
corregir daños del ADN antes de la replicación

 Si estos sistemas fallasen, la célula posee mecanismos alternativos

para tratar el ADN dañad en la horquilla de replicación

 A pesar de que la replicación no pueda continuar donde hay una lesión

(dímeros de pirimidina) usando ADN polimerasa, existen otras enzimas
especializadas que si copian a pesar de esta falla, esto es la síntesis de
ADN translesión

 La célula puede cuentear la lesión del ADN en la horquilla de

replicación, que puede ser corregida tras completar la replicación
ADN Polimerasa V
 La polimerasa especializada de la síntesis de ADN translesión es la
polimerasa V

 Fue descubierta por primera vez en E. coli en 1999

 Es inducida en respuesta a una extensa irradiación UV y puede

sintetizar una nueva hebra de ADN opuesta a un dímero de timina

 Otras dos ADN polimerasas en E.coli la I y la IV se inducen de forma

similar por el ADN dañado y funcionan en síntesis translesión
En eucariotas
 Se han descrito al menos 5 enzimas que intervienen en la síntesis
translesión en las células de mamífero.

 Solo sustituyen a la polimerasa normal en el sitio del daño

 Todas las ADN polimerasas especializadas muestran una baja fidelidad

cuando copian ADN no dañado y carecen de actividad correctora 3´ - 5´

 Sus tasas de error son entre 100 y 10.000 veces mayores que las tasas
de error de las ADN polimerasas replicativas normales
Reparación de roturas de doble hebra
 Las roturas de doble hebra durante la replicación del ADN representan
una variante especialmente peligrosa de daños del ADN, ya que
interrumpe la continuidad de dicha molécula.

 Son provocadas por la radiación ionizante como los rayos X y algunos

compuestos químicos que causan una rotura de doble hebra en el ADN

 La solución a este daño es la reparación recombinatoria

 En el ejemplo más simple, las roturas de hebra doble pueden repararse

simplemente volviendo a unir los extremos rotos de una sola molécula
de ADN
Recombinación homóloga
 Este sistema de reparación solo funciona después de la replicación del
ADN, cuando las cromátidas hermanas recién replicadas están aún
unidas

 La RH resulta de la rotura y nueva unión de dos moléculas de ADN

parentales , que da lugar a la reordenación de la información genética
de los dos cromosomas parentales

 El proceso se inicia en las roturas de hebra doble

 Ambas hebras de ADN son escindidas por nucleasas que digieren el

ADN en la dirección 5´ - 3´, produciendo extremos 3´ monocatenarios
colgantes
 Estas hebras únicas invaden entonces la otra molécula parental
mediante el emparejamiento de bases homólogas

 A continuación, los huecos se rellenan por síntesis reparadora y las

hebras se ligan para producir una molécula recombinante
Rec A y Rad51
 La proteína responsable de la recombinación homóloga es RecA en E.
coli y Rad51 en las células eucariotas

 Estas proteínas se unen al ADN monocatenario, formando filamentos

proteína-ADN.

 A continuación, se unen a la segunda molécula de ADN bicatenario,

formando un complejo entre los dos ADN y catalizan el intercambio de
hebras entre las secuencias homólogas.

 Hay que destacar que uno de los genes responsables del cáncer de
mama hereditario es el BRCA2 que codifica una proteína que recluta
Rad 51 hacia el ADN monocatenario generado en las roturas de hebra
doble, lo que indica que estas alteraciones en este tipo de reparación
pueden dar lugar al desarrollo de uno de los cánceres mas frecuente
en las mujeres