Métodos en Fisiología Vegetal

Tema 1: Introducción y
fraccionamiento subcelular.
1 ¿Qué estudia la Fisiología Vegetal?
La Fisiología Vegetal es la ciencia que estudia los distintos procesos funcionales que
sustentan la vida de las plantas.
Las principales áreas de investigación en Fisiología Vegetal son: fitoquímica, biología
celular y molecular, interacción celular (tejidos y órganos), crecimiento y desarrollo e
interacciones con el medioambiente.
Estos estudios incluyen, entre otros:
• La codificación y expresión de los caracteres vitales (genes, mensajeros, proteínas,
enzimas, etc.)
• Numerosas rutas metabólicas
• La regulación interna y ambiental de los procesos fisiológicos
Estos estudios se pueden realizar a diferentes escalas de complejidad biológica:
molecular, fracción intracelular, células completas, órganos, planta, comunidad
vegetal…
Gran parte de los estudios de Fisiología Vegetal requieren aislar diferentes tipos de
macromoléculas, células y/o orgánulos con el objetivo de estudiar un proceso
determinado en un contexto más simple que la planta, la célula o el órgano entero.

Un hito en la Fisiología Vegetal es el desarrollo de la ecuación de Hill por parte de

Robin Hill. l observó que, al iluminar una suspensión de cloroplastos en presencia de
compuestos oxidados capaces de aceptar electrones se producía desprendimiento de
oxígeno y reducción de estos aceptores según la reacción 2 A+ 2 H2O -> 2 AH2+ O2 que
es lo que también conocemos como fase luminosa de la fotosíntesis.

2 Fraccionamiento subcelular:
- Objetivo: protocolos y criterios básicos para obtener fracciones puras o
enriquecidas en un componente de la célula como orgánulos, complejos
moleculares, macromoléculas…
 - Etapas:
1) Ruptura de las células o tejidos para obtener un lisado celular.
Posteriormente se realiza una filtración para separar las células no lisadas y
fibras del material homogeneizado.
2) Separación de la fracción deseada del resto de componentes del tejido o de
la célula
Características distintivas de las células vegetales:
Las características distintivas de las células vegetales que más influyen en la selección
del método de fraccionamiento subcelular son la presencia de la pared celular
celulósica y la vacuola central del gran tamaño.
- Pared celular: Aporta rigidez, forma y protección a la célula. Posee varias capas
(lámina media de pectina, pared primaria de celulosa, hemicelulosa y pectina y
a veces pared secundaria de celulosa y lignina). Tiene un papel estructural,
confiriendo una alta resistencia frente a la ruptura mecánica y un papel de
protección frente a patógenos.
- Gran vacuola central: almacena agua, sales y enzimas hidrolíticas (como
defensa frente a la herbivoría) y metabolitos secundarios, con características
químicas capaces de alterar la macromolécula que nos interesa extraer. Cuando
la planta se encuentra bien provista de agua la vacuola está turgente y llega a
ocupar el 80% de la célula.
- Plastidios (cloroplastos): vitales en el proceso de fotosíntesis.

2.1 Ruptura celular: (ruptura=homogeneización)

Hay tres tipos de técnicas de homogeneización:
- Lisis celular: las células se suspenden en un medio hipotónico, haciendo que
entre agua en la célula desembocando en una turgencia extrema que acaba por
romper la membrana plasmática de la célula.
- Congelación/descongelación: se almacenan las muestras a -80oC durante 48h
para después descongelarlas rápidamente a 37oC.
- Destrucción mecánica: estos métodos producen la ruptura de las paredes
celulares, con lo que se libera el contenido celular.
Debido a la presencia de la pared celular en estudios de células o tejidos vegetales
se descartan las técnicas de lisis y congelación, ya que las propiedades de
resistencia a la ruptura de la pared impiden la lisis de la membrana plasmática
mediante estas técnicas.
Métodos de ruptura celular en vegetales: Hay dos tipos de procedimientos principales
en el caso de células vegetales:
1) Ruptura física: mediante morteros u homogeneizadores mecánicos de
diferentes diseños o mediante ultrasonido. Se emplea para obtener extractos
totales de ácidos nucleicos o proteínas, o con fracciones subcelulares
 relativamente resistentes al estrés mecánico como plastidios, mitocondrias o
núcleos.
- Mortero y mano: Pueden emplearse materiales abrasivos como cuarzo, vidrio
molido, arena o materiales silíceos (ventajas: rotura de tejidos y aislamiento de
orgánulos, desventajas: rotura de células aisladas como microalgas)
También puede congelarse la muestra con N2 líquido (ventajas: rotura de
células aisladas como microalgas y aislamiento de moléculas como ADN y
proteínas, desventajas: mal aislamiento de orgánulos).
En general, se cortan las hojas y se introducen en el mortero con N2 líquido que
las congela inmediatamente. Se machaca con la mano del mortero hasta
conseguir un polvo, antes de que se descongele se añade una sustancia de
ruptura (membranas, paredes…).

- Homogeneizadores de tubo y émbolo: el tubo suele ser siempre de vidrio, pero

el material del émbolo puede variar. El material de la muestra viene
previamente triturado. Sirve para aislar células y orgánulos, pero es poco
eficiente para el fraccionamiento de microorganismos. Se usa más en Fisiología
animal.

- Homogeneizador de esferas o molino de bolas: la muestra se introduce en un

tubo donde hay esferas que, dependiendo del fraccionamiento que se quiera
realizar, pueden ser de diferentes tamaños y materiales. La ruptura de las
células se produce por el impacto de las bolas a gran velocidad y de manera
repetitiva (hasta 30Hz). Constituye un método rápido para la homogeneización
simple de muchas muestras al mismo tiempo. Puede realizarse sin una
congelación previa, solo con tampón (ventajas: buena rotura de tejidos y
aislamiento de orgánulos, desventajas: se produce un rápido calentamiento por
la fricción de las bolas y tiene una baja eficacia en la rotura de células aisladas)
o con congelación mediante N2 líquido (ventajas: buena rotura de células
aisladas como microalgas y aislamiento de moléculas como ADN, proteínas…
desventajas: mal aislamiento de orgánulos).

- Blenders o licuadoras: homogeneización por la acción de cuchillas, usando un

tampón. Ventajas: se puede utilizar una gran cantidad de tejidos, rotura de
tejidos vegetales y aislamiento de orgánulos resistentes. Desventajas: no es
adecuado para el fraccionamiento de microorganismos y puede provocar
oxidación enzimática.

- Homogeneizador Rotor/Stator (Politron): rotor dentado que gira a alta

velocidad en el interior de un tubo perforado que permanece fijo. Ventajas:
rotura de tejidos vegetales y células y aislamiento de orgánulos. Desventajas:
Formación de espumas y aerosoles.
 - Sonicación: Ruptura de células mediante ultrasonidos, aunque es poco útil en
células vegetales debido a la presencia de pared celular. Los ultrasonidos
generan burbujas que al estallar producen un impacto en las células, lo que las
puede romper.

- Rotura por alta presión (French Press): ruptura de las células mediante
cambios de presión. Pasan de presiones extremadamente altas a 1 atm y
estallan. Se utiliza con células aisladas, protoplastos o microalgas, nunca con
tejidos.

Consecuencias de la ruptura celular:

La vacuola: La ruptura del tejido traerá aparejada la alteración del tonoplasto y la
liberación de las sustancias del interior de la vacuola (proteasas, fenoles…). De esta
forma estaremos poniendo en contacto moléculas que de manera natural se
encuentran separadas en diferentes compartimentos subcelulares. Como resultado de
esas interacciones, el ácido nucleico o proteína que podemos extraer podría ser
alterado de modo que sus propiedades no se correspondan a lo que está sucediendo
“in vivo”.
- Los fenoles de la vacuola: Al romper las células y sus vacuolas, los fenoles
vacuolares se ponen en contacto con el O2 del ambiente y se producen
derivados muy reactivos como radicales semiquinonas que alteran ácidos
nucleicos y proteínas. En proteínas, los derivados fenólicos provocan
alteraciones muy importantes, sobre todo en aminoácidos azufrados como la
cisteína. Para minimizar estas alteraciones se puede añadir cisteína libre u otro
compuesto con actividad redox del grupo -SH o añadir un secuestrante de
fenoles al medio.
- Proteasas: son enzimas que tienen actividad de degradación de proteínas y que
por lo tanto alterarían las estructuras y macromoléculas que queremos estudiar.
Tampón de aislamiento: se utiliza para resolver estas posibles alteraciones. Puede
constar de diferentes compuestos que solucionan diferentes problemas.

Problema Solución Agentes

Mantener la integridad de Que el medio sea Sacarosa/sorbitol
los orgánulos (que no isotónico
estallen)
Actividades proteasas, Inhibidores de actividades EDTA
nucleasas, lipasas… enzimáticas
Cambios en el pH Tampón Tris/HEPES/Fosfato
Oxidación Sustancias antioxidantes Ácido ascórbico
Alteraciones por fenoles Secuestradores de fenoles PVPP
(los precipita)
Además, es importante realizar las extracciones en frío (alrededor de 4oC), ya que así se
disminuye la actividad hidrolítica, la oxidación…
2) Método de ruptura celular en vegetales: Digestión enzimática de las paredes
celulares mediante enzimas que hidrolizan celulosa, hemicelulosa y pectinas,
originando protoplastos (células sin pared). Así ya podemos usar las otras
técnicas de homogeneización de lisis celular y congelación/descongelación y de
destrucción mecánica más suaves. Este método se utiliza para conseguir
fracciones subcelulares que son muy sensibles al estrés mecánico como
vacuolas, dictiosomas…
En resumen, para elegir el método que debemos usar para homogeneizar una muestra
debemos tener en cuenta: si lo que queremos aislar son orgánulos o macromolécula, si
queremos mantener su actividad/integridad y por lo tanto su resistencia o sensibilidad
a los diferentes métodos y las características físico-químicas del material del que
partimos. Teniendo en cuenta todo esto debemos de elegir los componentes
necesarios de nuestro tampón de aislamiento y debemos realizar la extracción en frío,
evitando así alteraciones que no nos permitan estudiar correctamente nuestros
componentes celulares.

2.2 Separación de fracciones subcelulares.

Centrifugación:
Objetivo: Separar una o más fracciones subcelulares, que pueden ser orgánulos o
macromoléculas, a partir de un lisado celular.
Centrifugación: Consiste en hacer girar un tubo a gran velocidad de forma que en el
fondo del mismo se depositen las partículas que tienen una mayor densidad que el
medio en el que se encuentran. Como resultado, podremos distinguir en el tubo la
fracción menos densa que llamamos sobrenadante y en el fondo la fracción más densa
que es el sedimento o precipitado.
Centrífuga: se usa para realizar las centrifugaciones. Es un instrumento giratorio que
permite someter a las muestras a una aceleración de la gravedad superior a la
terrestre. Lo que produce la rápida sedimentación de las partículas que son más densas
que el medio que las rodea. Poseen un motor, un rotor y una cámara acorazada.
Hay diferentes tipos de centrífugas en función de cuántas veces aumenta esta
aceleración gravitacional:
- Estándar (de pocas g a aprox. 3000 xg)
- De alta velocidad (de 2000 xg a 20000 xg)
- Ultracentrífugas (de 15000 xg a 600000xg)
Además, existen dos tipos de rotores:
 - De ángulo fijo: los tubos se colocan de manera fija y ligeramente inclinada.
Tiene como ventaja que permite alcanzar grandes velocidades de
centrifugación, pero en los tubos observamos una mala separación de las fases
o capas.
- Basculante: los tubos cuelgan verticalmente en posición de parada, pero se
colocan de manera horizontal durante el giro. Al contrario que con el anterior se
produce una buena separación de fases, pero no se pueden alcanzar grandes
velocidades de centrifugación.

Parámetros que determinan las condiciones de

centrifugación:
• Diferencial de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio
en la que se encuentra. A mayor diferencia, se requiere menor tiempo y
aceleración para sedimentar.
• Velocidad de centrifugación, determinará la aceleración de la gravedad que se
alcance en el interior de los tubos.
La fuerza generada por la centrifuga se expresa como fuerza centrífuga relativa
(RCF) en unidades de g. La RCF es una función de velocidad de centrifugación
en revoluciones por minuto (rpm) y el radio del rotor en cm (r).
RCF = 1,19 x 10-5 x (rpm)2 x r
La RCF es una proporción de dos fuerzas y no tiene unidades. Sin embargo,
tradicionalmente al valor numérico de la RCF le acompaña el símbolo “g”.
Instrucciones básicas para el uso de la centrífuga:

• Los tubos de ensayo deben colocarse en el rotor de forma simétrica (y por lo

tanto siempre debe de haber un número par).
• El volumen/peso de solución colocado en todos los tubos de ensayo debe de
ser igual.
Dependiendo del radio del rotor y de las revoluciones por minuto a las que gire se
llegan a alcanzar valores de RCF muy altos, por lo que un mal uso de la centrífuga
puede conllevar accidentes con alto poder destructivo en un laboratorio. Por esto,
es recomendable no alejarse de la centrífuga hasta que alcance la velocidad
deseada y estar atentos a vibraciones o ruidos extraños, pudiendo así minimizar
cualquier daño que se pueda producir en una centrífuga mal equilibrada.

Tipos de centrifugación:
1) Centrifugación diferencial: las partículas se separan en función de su masa y su
densidad y se produce fracciones brutas, suele ser el primer paso del
fraccionamiento. La separación es debida a la diferencia de velocidad de
sedimentación.
 Se basa en que en un lisado celular hay diferentes partículas de tamaño y
densidad variables y, a su vez, distinta a la del medio en el que se encuentran
dichas partículas, por lo que sedimentan a tasas de velocidad diferentes.
Si se centrifuga a velocidades crecientes de manera escalonada se puede
obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a
fracciones de diferente tamaño y/o densidad. Es decir, tendremos como
resultado de cada centrifugación un precipitado y un sobrenadante con unos
componentes específicos, pudiendo purificar cada vez fracciones subcelulares
más pequeñas.
La centrifugación diferencial permite aislar los orgánulos celulares en fracciones
heterogéneas cuando sus coeficientes de sedimentación difieren en al menos
un orden de magnitud.

2) Centrifugación en gradiente de densidad (isopícnica): separa las partículas en

función de la densidad, produciendo fracciones organelares más puras. La
separación se produce por los diferentes equilibrios de sedimentación.
Consiste en realizar una única centrifugación en un medio en el que ya exista un
gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la parte
inferior. Pasado un tiempo las diferentes partículas se habrán situado en
diferentes profundidades del tubo, los componentes de sedimentación lenta se
quedarán más arriba y los de sedimentación rápida más abajo. Haciendo un
pequeño orificio en el fondo, se pueden recoger las diferentes fracciones que
contengan a las distintas partículas por separado.
Las partículas se mueven por el tubo hasta que llegan a su punto isopícnico, es
decir, hasta que llegan a una profundidad en la que su densidad se iguala con la
del medio.
Formación de los gradientes de densidad:
• En el caso de los gradientes de CICs, se autogeneran durante la
ultracentrifugación.
• Los gradientes de sacarosa o Percoll se preforman mediante un
formador de gradientes.

2.3 Comprobación:
Como última etapa debemos de comprobar la pureza de las fracciones subcelulares
que hemos aislado. Lo podemos conseguir mediante distintas técnicas, las más usadas
son mediante inmunodetección y mediante un análisis de actividad enzimática.