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Estado del arte de la Biologa Molecular en Salud.

Las tecnologas valiosas terminan trasladandose de la investigacin al diagnostico.


Struct DNA 1953 Genetic code 1961 Cloning 1972 Southern 1975

Northern 1980 1st Affy Prototype 1989

HGP 2000

Microarray

1st EU Approved Diagnostic Array 2004

PCR

st PCR Discovered 1 1983

Diagnostic Use 1992

PCR Real-time 1998 1st Diagnostic Sequencing Kit HIV Genotyping 2001

Sequencing

Sanger Method1st Automated Sequencer 1977 1986

Immunology

Antibody Structure 1959


1950 1960

RIA & ELISA 1970s


1970

1st Diagnostic ELISA 1982


1980 1990

1st Approved Therapeutic 1997


2000

PCR TIEMPO REAL

INTRODUCCIN AL PCR TIEMPO REAL

PCR
Reaccin en Cadena de la Polimerasa: Kary Mullis (1983) Mtodo enzimtico in vitro para sintetizar DNA La reaccin utiliza dos partidores (oligonucletidos) que hibridizan en hebras opuestas del DNA y abarcan la porcin del gen que se desea amplificar Una serie repetitiva de ciclos (denaturacin, annealing y extensin) dan una acumulacin exponencial de un fragmento especfico de DNA El nmero de molculas de dsDNA aumenta al doble en cada ciclo (20 ciclos 220 106 copias)

ESQUEMA DE LOS CICLOS DE PCR

What is Real-Time PCR ?


1400 real-time PCR 1200 1000 800 600 400 200 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Real Time PCR


Fluorescencia es medida en cada ciclo de amplificacin (seal es proporcional al producto del PCR) La curva aumenta luego de un numero determinado de ciclos que es proporcional a la cantidad de DNA inicial.

Comparacin con una curva de Calibracin cuantificacin

Real-Time PCR is based on Fluorescence

Fluorescence is less sensitive when compared to radioactivity or enzyme-linked reactions


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Monitoring of PCR Reactions

From Block Cyclers to Real-Time PCR

Real-Time-PCR Instruments
SmartCycler LightTyper
Roche Diagnostics Cepheid

SDS7700
Applied Biosystems

Opticon
MJ Research

iCycler
BioRad

SDS7000
Applied Biosystems

LightCycler
Roche Diagnostics

7900HT
Applied Biosystems

RotorGene
Corbett Research

Mx3000/4000
Stratagene

Superconvector
AlphaHelix

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Application Principles

Quantification and qualitative detection

Mutation detection

Product identification

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FORMATOS DE DETECCIN

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Assay Formats

SYBR Green I SimpleProbe Probes HybProbe Probes Hydrolysis Probes and Universal ProbeLibrary Probes

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SYBR Green I Format

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HybProbe Detection Format

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Multiple HybProbe Detection

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Hydrolysis Probe Format

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Single Label Probe Format

SimpleProbe Probes

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Overview Applications and Dyes


Assay Format Detection Channel Reporter Dye Application

SYBR Green l

530

SYBR Green I

Product Characterization Quantification Quantification Mutation Analysis

HybProbe Probes

610 640 670 710


530 560

LightCycler RED 610 LightCycler RED 640 LightCycler RED 670 LightCycler RED 705
FAM VIC, HEX

TaqMan Probes

Quantification Mutation Analysis

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ANLISIS DE LA CURVA DE MELTING

Entrega la confirmacin de la secuencia del producto de PCR amplificado


Diferencia los productos especficos del PCR de los noespecficos (dmeros de primers) Es una poderosa herramienta para GENOTIPIFICAR SNPs y mutaciones

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Punto de Fusin
-d(F)/T

50C

75C

95C

T
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Monitoreo del PCR usando SYBR Green I


Anlisis

Cuantificacin

Melting Curve

Template: human genomic DNA; Target: -Globin; Detection Format: SYBR Green I
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Variacin en Tm del Producto


Tm vara por
Low GC 50 bp 41 C 10 C High GC 10,000 bp

Tm influenciada: concentracin Sales concentracin MgCl2 concentracin SYBR Green I


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OTROS FORMATOS DE DETECCIN


Molecular Beacon

LightUp Probe
Scorpion Primers QuantiProbes QZyme Lux Primers

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DISEO DE PRIMERS Un buen diseo ahorra TIEMPO Y DINERO qPCR buen diseo de primers (pej MULTIPLEX)

Que afecta la interaccin DNA-DNA


temperatura composicin de bases

concentracin de primers
tiempo

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UN BUEN PRIMER DEBERIA TENER... 18-24 pb 40-60% GC Distribucin balanceada de dominios ricos en G/C y A/T Tm que permita Tann de 55-65 C Sin estructura secundaria interna (Hairpins) UN BUEN PAR DE PRIMERS DEBERIA TENER Tm similares

No auto complementariedad (>3 pb) (especialmente en su extremo 3)

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PROBLEMA DE LOS DMEROS DE PRIMERS Primers unidos tb son amplificados en el PCR Esta reaccin compite con el PCR correcto y podra afectar a la eficiencia de la reaccin

SOLUCIN: Reducir autocomplementariedad Buen diseo

Reducir el tiempo de annealing


HotStart Touch Down
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Reducir la fluorescencia de los DPs

Usar sondas especficas

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DISEO COMPUTARIZADO Softwares gratis en Internet Primer3 FastPCR NetPrimer mFold Softwares comerciales

Primer Select (DNASTAR)


Primer Express (ABI) LC Probe Design (Roche)

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PLAN DE TRABAJO EN EL DISEO DE PRIMERS No


Encontrar Secuencias Diseo Primer Seleccionar Primers

OK

Si

Run PCR y

NCBI o Celera

Tm Tamao ampl Est Secund Especif

Electroforesis
en gel para chequear especificidad
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Dim Prim

DISEO DE SONDAS TaqMan


Tamao del amplicn 70-150 pb

Tm de la sonda 68-70 C
No G en extremo 5 Evitar extructura secundaria Evitar dimerizacin con primers Elegir secuencias con mas Cs que Gs

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EFICIENCIA DEL PCR Y CURVA DE CALIBRACIN

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AJUSTE DE LA LNEA DE BASE

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AJUSTE DE LA LNEA THRESHOLD

Nivel de Fluorescencia donde las muestras puedan ser comparadas

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LAS DIFERENTES FASES

Crec Exponencial

Plateau

Seal > background

MUESTRAS DEBEN SER COMPARADAS EN ESTA FASE

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Ct

Threshold line

Ct: ciclo terico donde las muestras intersectan a la lnea threshold Cp: propio del sistema LightCycler (mximo de la segunda derivada)

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FLUORESCENCIA VS NMERO DE COPIAS

D Threshold line

Muestra A > Muestra B > Muestra C > Muestra D La seal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de DNA (prod PCR) en la muestra La seal de fluorescencia de la muestra A comienza a incrementar antes que la muestra B La muestra A tiene mayor nmero de copias al inicio (NoA > NoB)
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CURVA ESTNDAR Estndars = templados diludos de concentracin conocida Curva estndar = Ct de cada muestra estndar es graficada en funcin de su concentracin conocida

Usada para determinar concentraciones de muestras desconocidas

Pend = entrega la eficiencia del PCR 10-1/pend = 1 + eficiencia Interc = # ciclos para detectar una molcula

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CURVA ESTNDAR FLUJO DE TRABAJO

PCR

Purificacin del Producto


Remover los DPs, fluorforos y

Determinacin de la concentracin Calcular la conc midiendo la A260nm y el largo del amplicn

Diluir y usar

Diluir en un amplio rango

componentes del
buffer

(106-10 copias/uL)

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ECUACIN DE LA AMPLIFICACIN

NCt = No (1+E)Ct
Nct = nmero de molculas luego de Ct ciclos de amplificacin No = nmero inicial de molculas

= eficiencia del PCR

Ct = ciclo threshold

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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN UN GEN, DOS MUESTRAS

(NCt)A = NoA2CtA (NCt)B = NoB2CtB


A B

(NCt)A = (NCt)B NoA2CtA = NoB2CtB NoA/NoB = 2DCt

100 % Eficiencia

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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN
UN GEN, DOS MUESTRAS EFICIENCIA DEL PCR

NoA / NoB = 2DCt


Eficiencia de PCR 100%
A B

NCt = No (1+E)Ct

NoA / NoB = (1+E)DCt

CMO DETERMINAR LA EFICIENCIA ?

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ESTIMACIN DE LA EFICIENCIA DEL PCR

Series de dilucin

E = 10 -1/pend -1 * 100
Pend ~ 3.3 100% eficiencia

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EFICIENCIA DEL PCR Expresada usualmente en porcentaje Muchos qumicos inhiben al PCR Cada muestra biolgica es nica en su composicin INHIBICIN

AFECTA A LA CUANTIFICACIN

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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN DOS GENES, DOS MUESTRAS

referencia

target

Dos muestras son corridas y dos genes son medidos. Por ejemplo, un gen target y un gen de referencia (housekeeping) o un control endgeno (spike)

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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN DOS GENES, DOS MUESTRAS

referencia

target

(NCt)Atarg = Notarg2CtAtarg (NCt)Aref = Noref2CtAref (NCt)Atarg (NCt)Aref

(NCt)Atarg = k * (NCt)Aref
NoAtarg/NoAref = k * 2DCt muestra A NoBtarg/NoBref = k * 2DCt muestra B
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ESTRATEGIA DE CUANTIFICACIN DOS GENES, DOS MUESTRAS

referencia

target

NoAtarg/NoAref = k * 2DCt muestra A NoBtarg/NoBref = k * 2DCt muestra B Eficiencia 100%

(NoA)targ/(NoA)ref = k * (1+Eref)Ctref/(1+Etarg)Cttarg muestra A


(NoB)targ/(NoB)ref = k * (1+Eref)Ctref/(1+Etarg)Cttarg muestra B
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Todo en la vida es Relativo !!!


"When you sit with a nice girl for two hours, it seems like two minutes. When you sit on a hot stove for two minutes, it seems like two hours; that's relativity."
Albert Einstein

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RT-PCR Quantification

Influencing Factors

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Tipos de Cuantificacin

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Tipos de Cuantificacin

Cuantificacin Absoluta
Con estndares externos
Efectos desconocidos de los inhibidores del PCR

Con estndares externos y un control interno


Verificacin de resultados en capilares individuales

No hay una correccin de los factores que influencian un PCR

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Tipos de Cuantificacin

Cuantificacin Relativa
RNA blanco en una muestra RNA referencia en una muestra

Radios son normalizados valores son corregidos para cada muestra

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Principio de la Cuantificacin Relativa

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Cuantificacin Relativa

Efecto de diferencias en la eficiencia del PCR

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DUDAS Y CONSULTAS ?

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