RE

CA AC
PO DE CI
LIM NA N
ER DE EN
AS
L
A: A
PC
R
Biotecnologa Mdica 2016
Ing.
Betty
Salazar
Pinto
bettysalazar2211@gmail.com

Material perteneciente a Ing. Cinthia Crdova Barrios

OBJETIVO

Dominar los fundamentos de la

tcnica de amplificacin de ADN
por PCR. Conocer los usos y
aplicaciones de la PCR en los
Laboratorios de Diagnostico
gentico molecular.

Introduccin.
Definicin y objetivos.
Requerimientos.
Etapas.
Caractersticas del proceso.
Variantes del mtodo.
Aplicaciones.

INTRODUCCIN

Kary Mullis (1993)

DEFINICIN Y OBJETIVOS
Amplificacin directa de una
regin especifica: un gen,
fragmento de DNA o cDNA,
presentes en mezclas de muy
diversas fuentes, obtenindose
mltiples copias en corto tiempo.

REQUERIMIENTOS
DNA diana

dNTPs y
Mg

Cebadores
o primers

DNA
polimerasa
o Taq

ETAPAS DEL CICLO

El termociclador repite estas tres fases de nuevo, segn el nmero total

de ciclos, que suele ser de 20 ciclos, generando 1 milln de copias (220)

CARACTERSTICAS DEL
PROCESO
Rendimiento
Duracin
Especificidad
Fidelidad

AUTOMATIZACIN
Uso de termocicladores.
Permite la realizacin de un nmero
elevado de ciclos.
Admite varias decenas de muestras
simultneas con volmenes comprendidos
entre 25 y 100 L.
Se aumenta la precisin del proceso.
Es sencilla y de bajo costo.

VARIANTES DEL
MTODO: qPCR
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa
(qPCR), mide la velocidad a la que se va
amplificando el DNA.

Amplificar y simultneamente cuantificar de forma absoluta

el producto.

Requiere de molde de ADN

Se requiere de un termociclador con capacidad de hacer

incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de
onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por
el fluorocromo excitado.

VARIANTES DEL MTODO:

RT-PCR

Amplificacin de RNA a
travs de la sntesis
previa de su cDNA, que
despus se amplifica
por PCR.

PCR larga o
L-PCR

Supera los lmites de la PCR convencional.

Amplifica con fidelidad regiones diana de gran tamao (40Kb).
Se aade otra enzima.

Realizar una segunda reaccin de PCR con dos cebadores nuevos que hibridan dentro
del fragmento diana amplificado por el primer par.
PCR anidada

PCR inversa

PCR con
adaptadores

Clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posicin vecinal a secuencias

diana conocidas.
Amplificar la regin externa que flanquea a los cebadores.

Puede amplificarse una regin de DNA de secuencia desconocida ligando a sus

fragmentos de restriccin unos adaptadores.

Se generan copias de hebra sencilla de un DNA.

PCR asimtrica Se aaden cantidades muy diferentes de ambos cebadores.

VARIANTES DEL MTODO: PCR

ANIDADA

PCR inversa

APLICACIONES
Secuenciacin de cidos nucleicos.
Establecimiento de polimorfismos de secuencia.
Rastreo de mutaciones.
Tipificacin de DNA para trasplante.
Diagnstico de enfermedades genticas.
Resolucin de problemas forenses.
Resolucin de problemas arqueolgicos.
Estudios evolutivos.
Deteccin de clulas tumorales.
Deteccin de microorganismos infecciosos.

 Veinte nanogramos de ADN genmico humano son

necesarios para una PCR. La solucin stock del molde se
encuentra a una concentracin de 0,2 mg ADN/mL.
Cuntos microlitros de la solucin stock deberan utilizarse?
Una nica molcula de ADN es amplificada por PCR durante
25 ciclos. Tericamente, Cuntas molculas de amplicn se
generarn?
Partiendo de 600 molculas de ADN molde. cuntos
amplicones se generarn despus de 25 ciclos de PCR?

MUCHAS
GRACIAS!!