UNIVERSIDAD VIÑA DEL MAR

ESCEULA DE CIENCIAS
LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

GUÍA DE LABORATORIO
PROCESOS BIOLÓGICOS II
PARA MEDICINA VETERINARIA

II SEMESTRE 2023
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ESCEULA DE CIENCIAS
LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA.

1. La asistencia a laboratorio es de un 100%. SE EXIGE PUNTUALIDAD.

2. El uso de delantal o cotona blanca es OBLIGATORIO, éste debe usarse abotonado.

3. El uso de pantalones cortos, faldas o vestidos queda estrictamente prohibido, así

como el uso de sandalias. Además, el pelo debe llevarse tomado.

4. NO puede ingerir alimentos ni bebidas en el laboratorio.

5. LOS TELÉFONOS CELULARES DEBERÁN PERMANECER APAGADOS O EN SILENCIO.

Todas las pertenencias de los alumnos deberán guardarse en casilleros dispuestos a la
entrada de los laboratorios, por lo que los alumnos deberán traer un candado para
resguardar sus pertenencias durante el desarrollo de la actividad programada. Una vez
terminada dicha actividad los alumnos deben retirar sus pertenencias de los casilleros, de
no hacerlo al finalizar la jornada los casilleros serán abiertos y las pertenencias encontradas
se dejarán al cuidado de Jefa de Laboratorios.

6. Los estudiantes que lleguen atrasados antes del término del control, podrán ingresar
y rendir el respectivo control de laboratorio (solo se aceptará un atraso en el semestre), los
estudiantes que no tengan su delantal NO PODRÁN INGRESAR AL LABORATORIO, lo cual
implica no rendir el control respectivo siendo calificado con nota 1.0 (uno coma cero).

7. NO se aceptará recuperar laboratorios en otros grupos.

8. El uso de la Guía de Laboratorio es OBLIGATORIO, los estudiantes que no tengan su

guía de laboratorio se les calificará con nota 1.0 (uno coma cero).

9. EVALUACIONES:

9.1 En TODOS los laboratorios se realizará un control de entrada, que comprenderá

materia del LABORATORIO ANTERIOR Y DEL LABORATORIO A EFECTUARSE. Este control
tendrá una duración máxima de diez minutos.

9.2 Al final del semestre se realizará un PRUEBA GLOBAL DE LABORATORIO, teórico/

práctico.

9.3 Las ponderaciones de Laboratorio son:

• 70%: Corresponde a quiz de inicio (40%) e informes (60%).

• 30%: Prueba global de laboratorio.

9.4 A LOS ALUMNOS QUE SEAN SORPRENDIDOS COPIANDO EN LOS CONTROLES, O EN

EL EXAMEN, SE LES RETIRARA LA PRUEBA, SIENDO CALIFICADOS CON NOTA 1.0 (uno coma
cero).

9.5 NO SE ELIMINAN NOTAS.

II SEMESTRE 2023
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LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

CALENDARIO DE ACTIVIDADES DE LABORATORIO

FECHA NOMBRE LABORATORIO

CUANTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS (Q)
14 al 18 AGOSTO
NRC
CUANTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS (Q)
21 AL 25 AGOSTO
NRC
28 AGOSTO al 01 MÉTODOS DE ESTUDIO DE BIOMOLÉCULAS 1 (B)
SEPTIEMBRE NRC
MÉTODOS DE ESTUDIO DE BIOMOLÉCULAS 1 (B)
04 AL 08 SEPTIEMBRE
NRC
MÉTODOS DE ESTUDIO DE BIOMOLÉCULAS 2 (Q)
11 al 15 SEPTIEMBRE
NRC
MÉTODOS DE ESTUDIO DE BIOMOLÉCULAS 2(Q)
25 AL 29 SEPTIEMBRE
NRC
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD
02 al 06 OCTUBRE ENZIMÁTICA (Q)
NRC
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD
16 al 20 OCTUBRE ENZIMÁTICA (Q)
NRC
30 OCTUBRE AL 03 METABOLISMO AERÓBICO (B)
NOVIEMBRE NRC

METABOLISMO AERÓBICO(B)
06 AL 10 NOVIEMBRE
NRC
BIOLOGÍA MOLECULAR (B)
13 AL 17 NOVIEMBRE
NRC
BIOLOGÍA MOLECULAR (B)
20 AL 24 NOVIEMBRE
NRC
PRUEBA GLOBAL DE LABORATORIO
27 NOVIEMBRE TODOS LOS NRC

II SEMESTRE 2023
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LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II
LABORATORIO N° 1. CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS

I. OBJETIVOS.
1. Preparar una curva de calibrado para la determinación de proteínas en solución.
2. Determinar la concentración de proteínas en una muestra problema aplicando la ley
de Lambert y Beer.

II. QUIZ.
Al iniciar el laboratorio deberá rendir una prueba de entrada (quiz) cuyas preguntas se
basan tanto en el fundamento teórico como en el procedimiento experimental de este
laboratorio.

- RECUERDE QUE DE ESTE LABORATORIO TIENE QUE ELABORAR UN REPORTE GRUPAL,

que deberá entregar al finalizar el práctico.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO.

Las proteínas son macromoléculas que desempeñan un rol básico en la función y estructura
celular. Los análisis de ciertas proteínas y enzimas que circulan en la sangre se emplean
extensamente con propósitos de diagnóstico.

Existen varios métodos para la determinación cuantitativa de proteínas en los que se

destacan el Método de Biuret y el Método de Folin-Lowry.

El Método de Biuret es utilizado como método cualitativo y cuantitativo en la

determinación de proteínas de materiales biológicos en solución. La reacción consiste en
tratar la proteína con sulfato de cobre en ambiente alcalino. El sulfato de cobre, en solución
alcalina, reacciona con compuestos que tienen dos o más enlaces peptídicos dando un
complejo de coloración violeta. La intensidad del color obtenido es una medida del número
de enlaces peptídicos presentes en la solución. El color se debe a la formación de un
complejo de coordinación del átomo de cobre y 4 átomos de nitrógeno, 2 de cada cadena
polipeptídica. El método de Biuret es reproducible para muchas proteínas, pero requiere de
mayor cantidad de proteínas (entre 10 a 20mg) para la formación del color. El color
obtenido de la reacción puede medirse a una longitud de onda de 540nm.

El método de Folin Lowry puede ser aplicado tanto a material seco como a soluciones de
proteínas. Es un método cuantitativo muy sensible, tanto así que se pueden medir muestras
que contengan alrededor de 5µg de proteínas fácilmente. El color formado por el reactivo
de Folin se debe a la reacción de la proteína con el cobre en solución alcalina y la reducción
del Cu+2 a Cu+1 por los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas.

Los iones cuprosos reducen las sales de fosfomolibdato-fosfotungstato del reactivo,

formando un complejo de color azul intenso. La intensidad del color depende del número
de aminoácidos aromáticos presentes en la proteína. Sin embargo, debido a que el
contenido de estos aminoácidos varía dentro de las proteínas, el color por miligramo de
proteína no es constante, sin embargo, el método es muy utilizado para seguir los cambios
en el contenido de proteínas durante la purificación de esta. El color obtenido de la reacción
puede medirse a una longitud de onda de 650nm.

IV. PARTE EXPERIMENTAL: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE

FOLIN-LOWRY.

A. Curva de calibrado y Muestra Problema (MP).

Prepare una batería de tubos, siguiendo el orden de reactivos tal como se indica en la tabla
Nº 1:

II SEMESTRE 2023
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Tubos (mL)

Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 MP
Reactivo Cuproalcalino 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Agua destilada 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 ---

Solución BSA (1.0 mg/ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ---

Solución MP --- --- --- --- --- --- 1.0

Tabla Nº1.

- Agitar suavemente cada tubo y dejar incubar 10 minutos a temperatura ambiente.

- Agregar 4 ml. de Reactivo Folin a TODOS los tubos.
- Agitar rápido y fuerte ¡¡sin tapar el tubo con los dedos!! Colocar en baño de agua a
55°C por 5 minutos.
- Enfriar bajo el chorro de agua ¡¡NO INTRODUCIR AGUA DENTRO DEL TUBO!!

B. Medición de Absorbancia.
- Lea las absorbancias de los tubos de la curva de calibrado y muestra problema en
el espectrofotómetro a 650 nm (nanómetros) utilizando para calibrar la muestra blanco.
- Registre los datos de absorbancia en la tabla Nº 2.

C. Registro de datos.
- Calcule las concentraciones de patrón en cada tubo de su curva de calibrado según
la ecuación:
V1 x C1= V2 x C2

Tubo Concentración patrón Absorbancia

1
2
3
4
5
Tabla Nº2.

D. Determinación de la concentración de proteínas en muestra problema.

- Realice un análisis de regresión lineal con los datos de concentración patrón y
absorbancia de su curva de calibrado para obtener el coeficiente de extinción lineal (ε).
- Calcule la concentración de proteínas presente en la muestra problema utilizando
la ley de Lambert y Beer A = ε • C • L.

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REPORTE LABORATORIO N°1

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROFOTOMERÍA
UTILIZANDO EL MÉTODO DE FOLIN-LOWRY

NOMBRE INTEGRANTES:
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

NRC: ……………

1. Calcule las concentraciones de patrón en cada tubo de su curva de calibrado según la ecuación e
indique la absorbancia obtenida para cada una de ellas: (5 puntos)

V1 x C1= V2 x C2

Tubo Concentración patrón Absorbancia

1
2
3
4
5

2. De los acuerdo a los datos de la curva de calibrado, indique: (3 puntos)

Pendiente (b):………………….

Intercepto (a) : …………………

Índice de correlación lineal (r): ………………..

3. Calculo de la Concentración de la Muestra Problema proporcionada. (4 puntos)

II SEMESTRE 2023
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Conteste: (1 punto cada una)

1. ¿Qué unidades tiene el coeficiente de extinción calculado? ¿De dónde las obtiene?

2. ¿Por qué debió calcular las concentraciones de patrón para cada tubo?

3. ¿Qué concluye respecto del valor obtenido de su índice de correlación?

4. ¿Por qué los métodos utilizados le permitieron calcular la concentración de la muestra problema?

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LABORATORIO Nº 2 METODOS DE ESTUDIO I.

DETERMINACIÓN DE BIOMOLECULAS: PROTEÍNAS.

I. OBJETIVOS.
El propósito de esta práctica es evidenciar presencia de proteínas en una muestra
problema.

II. QUIZ.
Al iniciar el laboratorio deberá rendir una prueba de entrada (Quiz) cuyas preguntas se
basan tanto en el fundamento teórico como en el procedimiento experimental de este
laboratorio.

- RECUERDE QUE DE ESTE LABORATORIO TIENE QUE RENDIR UN QUIZ VIRTUAL.

Introducción:

Las proteínas son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y
nitrógeno. Pueden además contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro,
magnesio y cobre entre otros elementos.

Pueden considerarse polímeros de unas pequeñas moléculas que reciben el nombre de

aminoácidos y serían por tanto los monómeros. Los aminoácidos están unidos mediante
enlaces peptídicos.

La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido; si el N° de aminoácidos,

que forma la molécula no es mayor de 10, se denomina oligopéptido, si es superior a 10 se
llama polipéptido y si es superior a 50 se habla de proteína.
De todas las moléculas de importancia biológica, las proteínas son las más versátiles.
Muchas proteínas tienen actividad biológica, como por ejemplo las enzimas y las
inmunoglobulinas. Otras son proteínas de transporte que facilitan o controlan el
movimiento de sustancias a través de las membranas en las
células. Otras actúan como hormonas y otras como parte
estructural de las células (ej: microtúbulos y
microfilamentos del citoesqueleto).

LOS AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos se caracterizan por poseer un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino
(-NH2).

EL ENLACE PEPTÍDICO
Los péptidos están formados por la unión de aminoácidos mediante un enlace peptídico. Es
un enlace covalente
que se establece entre
el grupo carboxilo de un
aminoácido y el grupo
amino del siguiente,
dando lugar al
desprendimiento de
una molécula de agua.

II SEMESTRE 2023
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LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

El enlace peptídico tiene un comportamiento similar al de un enlace doble, es decir,

presenta una cierta rigidez que inmoviliza en un plano los átomos que lo forman.

ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS.

La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales
denominados: estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura
cuaternaria.

ESTRUCTURA PRIMARIA. La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la

proteína. Nos indica qué aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que
dichos aminoácidos se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y
de la forma que ésta adopte.

ESTRUCTURA SECUNDARIA. La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de

aminoácidos en el espacio. Los aminoácidos, a medida que van siendo enlazados durante la
síntesis de proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una
disposición espacial estable, la estructura secundaria.

Existen dos tipos de estructura secundaria:

1. la α(alfa)-hélice
2. la conformación β (beta)

La estructura en α(alfa)-hélice se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la

estructura primaria. Se debe a la formación de enlaces de hidrógeno entre el -C=O de un
aminoácido y el -NH- del cuarto aminoácido que le sigue.

II SEMESTRE 2023
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LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

En la conformación beta los aminoácidos no forman una hélice sino una cadena en forma
de zigzag, denominada disposición en lámina plegada.

ESTRUCTURA TERCIARIA. La estructura terciaria informa sobre la disposición de la

estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una
conformación globular.
Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones de
transporte, enzimáticas, hormonales, etc.
Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los
radicales R de los aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces:

1. Puente disulfuro entre los radicales de aminoácidos que tiene azufre.

2. Puentes de hidrógeno
3. Puentes eléctricos
4. Interacciones hidrófobas.

ESTRUCTURA CUATERNARIA. Esta estructura informa de la unión, mediante enlaces débiles

(no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un
complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de
monómero.
El número de monómeros varía desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la
hemoglobina, o muchos como la cápside del virus de la poliomielitis, que consta de 60
unidades proteicas.

II SEMESTRE 2023
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LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

CARACTERISTICAS DE LAS PROTEINAS.

1. Especificidad.
La especificidad se refiere a la función; cada una lleva a cabo una determinada función y lo
realiza porque posee una determinada estructura primaria y una conformación espacial
propia; por lo que un cambio en la estructura de la proteína puede significar una pérdida
de la función.

2. Desnaturalización.
Consiste en la pérdida de la estructura terciaria, por romperse los puentes que forman dicha
estructura. Todas las proteínas desnaturalizadas tienen la misma conformación, muy
abierta y con una interacción máxima con el solvente, por lo que una proteína soluble en
agua cuando se desnaturaliza se hace insoluble en agua y precipita.
La desnaturalización se puede producir por cambios de temperatura, variaciones del pH,
etc. En algunos casos, si las condiciones se restablecen, una proteína desnaturalizada puede
volver a su anterior plegamiento o conformación, proceso que se denomina
renaturalización.

ACTIVIDAD N°1: RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS.

MATERIALES
Tubos de ensayo Solución de HCl concentrado
Mechero Solución de CuSO4 al 1%
Vasos de precipitados NaOH al 20%
Gradilla Alcohol etílico
Pipetas Clara de huevo o leche
Solución de albúmina al 1%

REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET).

Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su
identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las
proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-
NH que se destruye al liberarse los aminoácidos.

El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y NaOH, y el Cu, en un medio fuertemente
alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta
(Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas.

MÉTODO
- Colocar en un tubo de ensayo 3mL de solución de albúmina al 1-2%.
- Añadir 4-5 gotas de solución de CuSO4 al 1%.
- Añadir 3mL de solución de NaOH al 20%.
- Agitar para que se mezcle bien.
- Observar los resultados.

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LABORATORIO Nº 3 METODOS DE ESTUDIO II.

DETERMINACIÓN DE BIOMOLECULAS: LIPIDOS Y CARBOHIDRATOS.

I. OBJETIVOS.
El propósito de esta práctica es evidenciar presencia de lípidos y carbohidratos en una
muestra problema.

II. QUIZ.
Al iniciar el laboratorio deberá rendir una prueba de entrada (Quiz) cuyas preguntas se
basan tanto en el fundamento teórico como en el procedimiento experimental de este
laboratorio.

- RECUERDE QUE DE ESTE LABORATORIO TIENE QUE RENDIR UN QUIZ VIRTUAL.

Lípidos:

Los lípidos son biomoléculas orgánicas formadas básicamente por carbono, hidrógeno y
oxígeno, este último en porcentajes mucho más bajos. Además, pueden contener fósforo,
nitrógeno y azufre. Es un grupo de sustancias muy heterogéneas que sólo tienen en común
estas dos características: Son insolubles en agua Son solubles en disolventes orgánicos,
como éter, cloroformo, benceno, etc.

CLASIFICACIÓN DE LOS LÍPIDOS.

Los lípidos se clasifican en dos grupos, atendiendo a que posean en su composición ácidos
grasos (Lípidos saponificables) o no lo posean (Lípidos insaponificables).

A. Lípidos saponificables

1. Simples
Acilglicéridos
Céridos

2. Complejos
Fosfolípidos
Glucolípidos

B. Lípidos insaponificables
1. Terpenos
2. Esteroides
3. Prostaglandinas

ÁCIDOS GRASOS.
Los ácidos grasos son moléculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada de tipo
lineal, y con un número par de átomos de carbono. Tienen en un extremo de la cadena un
grupo carboxilo (-COOH).

Se conocen unos 70 ácidos grasos que se pueden clasificar en dos grupos:

• Los ácidos grasos saturados sólo tienen enlaces simples entre los átomos de
carbono. Son ejemplos de este tipo de ácidos el palmítico (16°C) y el esteárico (18°C).
• Los ácidos grasos insaturados tienen uno o varios enlaces dobles en su cadena, con
cambios de dirección en los lugares donde aparece un doble enlace. Son ejemplos el oleico
(18°C, un doble enlace) y el linoleico (18°C y dos dobles enlaces).

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PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS GRASOS.

• Solubilidad. Los ácidos grasos poseen una zona hidrofílica, y una zona lipofílica. Por
eso las moléculas de los ácidos grasos son anfipáticas, pues, por una parte, la cadena
alifática es apolar y por tanto, soluble en disolventes orgánicos (lipofílica), y por otra, el
grupo carboxilo es polar y soluble en agua (hidrofílica).

• Almacén de energía. Los lípidos apolares cumplen funciones de almacén de energía

metabólica, lubricación y protección, mientras que los polares tienen funciones
estructurales, o sea, que participan en la composición de las membranas biológicas. Además
de éstos, otros lípidos cumplen otras funciones más específicas, como vitaminas, hormonas,
etc.

• Químicamente, los ácidos grasos son capaces de formar enlaces éster con los grupos
alcohol de otras moléculas. Cuando estos enlaces se hidrolizan con una base como el NaOH,
se rompen y se obtienen las sales de los ácidos grasos correspondientes, denominados
jabones, mediante un proceso denominado saponificación.

ACTIVIDAD N° 2. RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS.

SAPONIFICACIÓN.
Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido de sodio NaOH descomponiéndose en:
glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para
dar jabones, que son en consecuencia las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En
los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas
específicos (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina.

MÉTODO
- Colocar en un tubo de ensayo 2mL de aceite y 2mL de NaOH al 20%.
- Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos.
- Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que
contiene la solución de NaOH sobrante junto con la glicerina formada, otra
intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite
inalterado.

II SEMESTRE 2023
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LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

CARBOHIDRATOS.
Los carbohidratos (azúcares) son compuestos orgánicos que contienen carbono, hidrógeno
y oxígeno en relación 1:2:1. Los carbohidratos biológicamente más importantes son los que
contienen 4, 5, 6 y 7 átomos de carbono (designados como C4, C5, C6 y C7).
Las pentosas son azúcares de 5 carbonos (C5) que forman el esqueleto de los ácidos
nucleicos.
A su vez, las hexosas, azúcares de 6 carbonos (C6) son los monómeros de los polímeros de
la pared celular y de las reservas de energía.

Polisacáridos y enlace glucosídico. Los polisacáridos son carbohidratos de alto peso

molecular que contienen muchas unidades monoméricas conectadas entre sí por enlaces
covalentes denominados enlaces glucosídicos. Si se unen dos unidades de azúcar
(monosacáridos) por enlace glucosídico la molécula que resulta es un disacárido. La adición
de otro monosacárido origina un trisacárido, y la de varios más un oligosacárido; una
cadena larga de monosacáridos unidos por enlace glucosídico constituye un polisacárido.

Los polisacáridos son importantes reservas de carbono y energía en bacterias, plantas y

animales, además se pueden combinar con otras clases de macromoléculas, tales como
proteínas y lípidos, para formar glucoproteínas y glucolípidos.

ACTIVIDAD N°3.

El almidón es un polisacárido vegetal formado por dos componentes: la amilosa y la

amilopectina. La primera se colorea de azul en presencia de yodo debido no a una reacción
química sino a la adsorción o fijación de yodo en la superficie de la molécula de amilosa, lo
cual sólo ocurre en frío. Como reactivo se usa una solución denominada lugol que contiene
yodo y yoduro potásico. Como los polisacáridos no tienen poder reductor, la reacción de
Fehling da negativa.

MÉTODO

- Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la solución de almidón.

- Añadir 3 gotas de la solución de lugol.
- Observar y anotar los resultados.
- Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color.
- Enfriar el tubo de ensayo al grifo y observar cómo, a los 2-3 minutos, reaparece el
color azul.

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LABORATORIO N° 4.

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.

I. OBJETIVOS.
El propósito de esta práctica es determinar el efecto del pH y la temperatura sobre la
reacción catalizada por la enzima Fosfatasa, y determinar su naturaleza ácida o básica.

II. QUIZ.
Al iniciar el laboratorio deberá rendir una prueba de entrada (Quiz) cuyas preguntas se
basan tanto en el fundamento teórico como en el procedimiento experimental de este
laboratorio.

- RECUERDE QUE DE ESTE LABORATORIO TIENE QUE ELABORAR UN REPORTE GRUPAL,

que deberá entregar al finalizar el práctico.

III. FUNDAMENTO TEORICO.

Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las
reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos, disminuyendo el nivel de la "energía
de activación" propia de la reacción. Las enzimas no reaccionan químicamente con las
sustancias sobre las que actúan, que se denominan sustrato, ni alteran el equilibrio de la
reacción, solamente aumentan la velocidad con que estas se producen, actuando como
catalizadores.
En general, la velocidad de la reacción enzimática se incrementa con la temperatura hasta
que un punto máximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el número de
moléculas ricas en energía que pueden pasar la barrera energética de estado de transición,
para formar a los productos. La elevación excesiva de la temperatura del medio que
contiene a las enzimas resulta en una disminución de la velocidad como resultado de la
desnaturalización, es decir, la pérdida de la estructura tridimensional de las enzimas.
La concentración de H+ afecta la velocidad de la reacción en muchas formas. Primero el
proceso catalítico usualmente requiere que la enzima y el substrato tengan grupos químicos
en una forma iónica particular para poder interactuar. Por ejemplo, la actividad catalítica
puede necesitar a un grupo amino de una lisina en estado protonado (-NH3+) o no protonado
(-NH2+), el pH modifica este estado y por tanto a la velocidad de la reacción. pH extremos
(altos o bajos) pueden ocasionar la desnaturalización de las enzimas, debido a que la
estructura con estos cambios es posible modificar las interacciones iónicas que intervienen
en la estabilidad de la enzima en su estado nativo. El pH al cual las enzimas adquieren su
máxima actividad es diferente para cada una de ellas y depende de la secuencia de
aminoácidos que las conforman, por supuesto, también está relacionado con el
microambiente celular en el cual desarrollan su catálisis. Por ejemplo, la pepsina que es una
enzima digestiva que actúa en el estómago, posee un pH óptimo de alrededor de 2
unidades, por el contrario, otras enzimas que actúan a pH neutro, se desnaturalizan a pH
alcalino o ácido.

En la mayor parte de las preparaciones la concentración molar real de una enzima no se

conoce. En consecuencia, la cantidad de enzima presente sólo puede ser expresada en
términos de actividad. Para estandarizar la actividad de una enzima, la Comisión de Enzimas
de la Unión Internacional Bioquímica ha definido una unidad estándar como aquella
cantidad de enzima que cataliza la formación de un mol de producto por minuto bajo
condiciones de ensayo definidas. La concentración de enzima en una preparación impura
se expresa en términos de unidades/ml (U/ml).
Las enzimas se sintetizan en la célula y ejercen su acción usualmente en el interior de ellas.
Otras enzimas, una vez sintetizadas, salen de las células y funcionan fuera de ellas, por
ejemplo, las enzimas del tubo digestivo y las del suero sanguíneo.

II SEMESTRE 2023
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LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

En este práctico se estudiarán los efectos de factores como pH y temperatura en la cinética

de Fosfatasas empleando como sustrato el éster fosfórico, paranitrofenilfosfato de sodio
(PNFP). La velocidad de reacción se estimará analizando la aparición de producto
paranitrofenol medido espectrofotométricamente.

PNFP → PNF + P

IV. Parte Experimental.

Para todos sus cálculos utilice  PNF: 0.018 L/(mol*cm).

1. Efecto del pH en la velocidad de reacción enzimática.

Prepare una batería de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVOS 1 2 3 Blanco
p- nitrofenilfosfato de Na 0.02 M 0.4 0.4 0.4 0.4
Tampón pH= 3 2.0 - - -
Tampón pH= 6 - 2.0 - -
Tampón pH= 10 - - 2.0 -
Agua destilada 1.6 1.6 1.6 3.6

- Mezcle bien cada tubo y agregue 10µL de enzima a cada uno de ellos, excepto al
tubo Blanco.
- Mezcle bien y coloque los tubos en baño de agua a 38°C durante 10 minutos.
- Al finalizar la incubación, agregue 3ml de solución de Na2CO3 1,0M a todos los tubos.
- Déjelos enfriar y lea la absorbancia a 420nm, usando para calibrar el tubo blanco.

2. Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción enzimática.

Prepare una batería de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVOS Tº amb. 38ºC 60ºC

- p- nitrofenilfosfato de Na 0.02 M (ml) 0.4 0.4 0.4
Tampón citrato 0.3 M pH 3 (ml) 2.0 2.0 2.0
Agua destilada (ml) 1.6 1.6 1.6

Mezcle bien cada tubo y agregue 10µl de enzima a cada uno de ellos.
- Mezcle bien y coloque los tubos a la temperatura de incubación correspondiente
por 10 minutos.
- Al finalizar la incubación, agregue 3mL de solución de Na2 CO3 1,0M a todos los
tubos.
- Déjelos enfriar y lea la absorbancia a 420nm, usando para calibrar el tubo blanco
del experimento anterior.

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ESCEULA DE CIENCIAS
LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

REGISTRE TODOS SUS DATOS Y CALCULOS EN LAS SIGUIENTES TABLAS:

1. Efecto del pH en la velocidad de reacción enzimática.

Absorbancia [p-
TUBO Tiempo V0 Tº
p-nitrofenol nitrofenol]
1
2
3

2. Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción enzimática.

Absorbancia [p-
TUBO Tiempo V0 pH
p-nitrofenol nitrofenol]
1
2
3

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LABORATORIO PROCESOS BIOLÓGICOS II

REPORTE DE LABORATORIO 4
EFECTO PH Y TEMPERATURA EN LA VELOCIDAD ENZIMATICA

NOMBRE INTEGRANTES: ……………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
NRC: …………… CARRERA: ……………………………... PROFESORES: ………………………………………………….….

REGISTRE TODOS SUS DATOS Y CALCULOS EN LA SIGUIENTES TABLAS:

1. Efecto del pH en la velocidad de reacción enzimática.

Complete la tabla (5ptos.)

TUBO Absorbancia [p-nitrofenol] Tiempo V0 pH
p-nitrofenol

1
2
3

Escriba todos los cálculos para determinar velocidad (3ptos.).

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2. Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción enzimática.

Complete la tabla (5 ptos.)

TUBO Absorbancia [p-nitrofenol] Tiempo V0 T°
p-nitrofenol

1
2
3

Escriba todos los cálculos para determinar velocidad (3ptos.).

3. Determine la temperatura y pH óptimos de la enzima y el tipo de fosfatasa (6ptos.)

T°: ………………. pH: ……………….. Tipo: …………………

4. ¿Por qué las enzimas poseen estos valores óptimos?.

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LABORATORIO N° 5
METABOLISMO AEROBICO

I. OBJETIVOS.
El propósito de esta práctica es identificar la actividad de algunas enzimas específicas
presentes en el tejido animal como la Citocromo oxidasa y la Succínico deshidrogenasa,
mediante el uso de aceptores electrónicos coloreados e identificar el efecto inhibitorio de
algunas sustancias sobre este sistema enzimático.

II. QUIZ.
Al iniciar el laboratorio deberá rendir una prueba de entrada (Quiz) cuyas preguntas se
basan tanto en el fundamento teórico como en el procedimiento experimental de este
laboratorio.

- RECUERDE QUE DE ESTE LABORATORIO TIENE QUE ELABORAR UN REPORTE GRUPAL,

que deberá entregar al finalizar el práctico.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO.

Cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa: Es un proceso que se lleva a
cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido por una serie de complejos
enzima-coenzima de Oxidorreductasas y Ferroproteínas. La actividad del complejo
Citocromo C oxidasa puede demostrarse experimentalmente mediante un dador artificial
de electrones, la p-Fenilendiamina (pFDH2), que al reducir al complejo IV de la cadena,
cambia de una coloración café clara a café oscura dado que en su forma oxidada es una
sustancia muy reactiva que se condensa y polimeriza fácilmente. De esta forma se evidencia
el transporte electrónico a través del complejo IV.

El Ciclo de Krebs y la Succinato Deshidrogenasa (SDH): Es una enzima que se encuentra

asociada a la membrana interna de la mitocondria y conecta al Ciclo de Krebs. Oxida al
Succinato y produce FADH2, el cual vuelve a reoxidar generando un flujo de electrones a
través de la cadena transportadora de electrones. Es inhibida en forma competitiva con la
presencia de ácidos dicarboxílicos como el Malonato, Malato, Oxalacético y Oxálico, los
cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulación de
Succinato. El proceso se puede evidenciar experimentalmente mediante el uso de un
aceptor electrónico artificial como el Azul de Metileno, que es coloreado cuando se
encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce. El transporte de electrones iniciado por
Succinato, lleva finalmente a que los electrones sean aceptados por el Azul de Metileno
volviéndose esta solución incolora, siempre y cuando la solución esté privada de oxígeno.

IV. PROCEDIMIENTO.

1. Seguimiento de la reacción catalizada por la Citocromo Oxidasa:

Prepare una batería de tubos debidamente marcados según la siguiente tabla:

- Mezcle bien el contenido de cada tubo e incube a 37ºC hasta cuando aparezca el
complejo coloreado.
- Anote y comente los resultados obtenidos en cada tubo.

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2. Seguimiento de la reacción catalizada por la Succinato Deshidrogenasa:

Prepare una batería de tubos debidamente marcados según la siguiente tabla:

- Antes de agregar el extracto enzimático, deje los tubos incubando a 37ºC durante
10 minutos, y sin retirarlos del baño agregue el extracto enzimático, inmediatamente agite
bien y coloque el aceite mineral.
- Espere a que los tubos se decoloren.
- Comente los resultados obtenidos en cada tubo.

Una vez realizado el práctico, conteste las siguientes preguntas:

1. ¿Por qué utiliza Aceite mineral?

2. ¿Cuál es la función del Malonato de Sodio?
3. ¿Cuál es la función del Cianuro de potasio?
4. ¿Para que utiliza distintas cantidades de extracto enzimático en el ensayo de la
Succinato deshidrogenasa, en los tubos 1, 2 y 3?

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REPORTE DE LABORATORIO N° 5: METABOLISMO AERÓBICO

NOMBRE INTEGRANTES: ……………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
NRC: …………… CARRERA: ……………………………... PROFESORES: ………………………………………………….….

I. RESPONDA:

1. ¿Cuál es la función del extracto enzimático en ambos ensayos? (1pto.).

2. Describa brevemente la cadena trasportadora de electrones. (1pto.).

II. DE ACUERDO A LO REALIZADO EN SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN CATALIZADA

POR LA CITOCROMO OXIDASA:

1. Complete la siguiente tabla: (4ptos.).

Tubo B Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Color

Justificación del
color

2. ¿Cuál es la función del Malonato de Sodio? (1pto.).

3. ¿Cuál es la función del Cianuro de potasio? (1pto.).

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4. ¿Cuál es la función de la parafenildiamina? (1pto.).

III. De acuerdo a lo realizado en Seguimiento de la reacción catalizada por la Succinato

Deshidrogenasa:

1. Complete la siguiente tabla: (5ptos.).

Tubo B Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Color

Justificación
del color

2. ¿Cuál es la función del Succinato de Sodio? (1pto.).

3. ¿Para que utiliza distintas cantidades de extracto enzimático en el ensayo de la

Succinato deshidrogenasa, en los tubos 1, 2 y 3? (1pto.).

4. ¿Por qué utiliza Aceite mineral? (1pto)

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LABORATORIO N° 6

GENETICA MOLECULAR: PCR Y ELECTROFORESIS EN GEL DE

AGAROSA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

I. OBJETIVOS.

- Identificar la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como proceso

molecular.
- Familiarizar a los alumnos en los procedimientos implicados en la electroforesis en
gel de agarosa para separar moléculas biológicas.

II. QUIZ.

Al finalizar el laboratorio deberá rendir una prueba (quiz) cuyas preguntas se basan tanto
en el fundamento teórico como en el procedimiento experimental de este laboratorio.

- RECUERDE QUE DE ESTE LABORATORIO TIENE QUE ELABORAR UN REPORTE GRUPAL,

que deberá entregar al finalizar el práctico.

III. INTRODUCCION.

La genética molecular es la rama de la genética que analiza, a nivel molecular, la estructura

y la función del material genético basándose en métodos de biología molecular.

Sin lugar a dudas, los usos potenciales de la genética molecular en el campo de la ganadería
y agricultura, van mucho más allá de la producción de animales portadores de genes
exógenos, con relativa o mucha importancia comercial. La caracterización de genes que
codifican caracteres cuantitativos con importancia económica o de genes causantes de
enfermedades congénitas ha llegado a tener tanta o más importancia que la generación de
animales transgénicos.
Enfermedades infecciosas o parasitarias han arrasado más de una vez con la población
mundial, matando o debilitando a miles de habitantes. Por su parte las enfermedades
genéticas, aunque menos diseminadas, producen un resultado similar, afectando
poblaciones humanas y animales.
Estos hechos han convertido a las técnicas de genética molecular en herramientas
fundamentales para la detección de estas enfermedades no sólo en la especie humana, sino
que ahora han ingresado al mundo de la veterinaria.

Aunque pueda parecer sorprendente la genética molecular han contribuido eficazmente a

las herramientas de trabajo en el uso del campo y animal. Esto se debe a que debido a los
conocimientos que derivan de la genética molecular podemos incrementar la calidad tanto
de animales como plantas. ¿Cómo? Gracias al cruce de análisis genéticos a través del cual
sabemos los genes más relevantes para el desarrollo de las características que queramos
lograr.

FUNDAMENTO TEORICO.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA.
PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en
Cadena de la Polimerasa. PCR es una técnica enzimática que permite la amplificación de
ácidos nucleicos (DNA o RNA), millones de veces. Esta técnica simula el proceso de
replicación que ocurre naturalmente en las células a la hora de sintetizar células hijas. Esto
hace que el PCR sea una técnica muy poderosa en amplios campos de la biología, las
ciencias, la medicina forense, la biotecnología, etc. La técnica de PCR fue desarrollada por
el Doctor Kary Mullis, que le valió el premio Nobel de Química en 1993.

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Habitualmente, los resultados de una reacción de PCR se visualizan (se hacen visibles) al
usar electroforesis en gel.

Algunas aplicaciones de la técnica de PCR:

• Diagnostico medico: Para detectar e identificar agentes infecciosos tales como: virus,
bacterias, parásitos, hongos, etc.
• Detección de enfermedades genéticas: Ejemplo, determinar sí una mutación específica
que provoca fibrosis quística ha sido heredada por los hijos.
• Estudios evolutivos: analizar las relaciones filogenéticas entre especies desaparecidas
(muestras arqueológicas) y de especies vivientes.
• “DNA fingerprinting”: Perfil de productos de amplificación específicos de cada individuo
de una población. Esto permite identificar personas desaparecidas, autores de crímenes,
etc.
El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de fragmentos
cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento a
amplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que una enzima polimerasa sea
capaz de incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde. Una vez
completada la reacción la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante
técnicas sencillas de separación de fragmentos de DNA.

COMPONENTES DE LA PCR.

Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener muchas

copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar este fragmento y utilizarlo
en otras aplicaciones si es necesario. Para alcanzar este resultado, ¿qué es necesario
añadir a la reacción?

o El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, puede
provenir de la extracción de varias fuentes biológicas o tejidos. El DNA o gen a
amplificar se define como “target” (diana). Este DNA se conoce como DNA molde.

o Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una DNA
polimerasa. (La DNA polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa,
por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló, Thermus aquaticus).

La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para el funcionamiento de la

enzima polimerasa. Además, como cofactores de la polimerasa se añaden cationes
divalentes, generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).

o Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente son capaces de

añadir nucleótidos al extremo 3’OH libre de una doble cadena de DNA. Son
necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de DNA de cadena
sencilla, sintetizados químicamente para que se correspondan con los extremos del
gen a amplificar Estas moléculas son los cebadores o primers de la reacción. Cada
cebador se une a uno a los extremos del gen a amplificar.
Son los cebadores los que van a delimitar el fragmento a amplificar.
El diseño de oligonucleótidos para PCR debe reunir varias características, siendo las
más importantes la Tm (temperatura a la cual la mitad de las moléculas están unidas
al templado) y la longitud del oligonucleótido. Con base en la Tm se define la
temperatura de alineamiento (Ta) en el termociclador. Si la Ta es muy baja ocurrirán
alineamientos inespecíficos, mientras que si la temperatura es muy alta la unión del
oligonucleótido será muy pobre. Generalmente se define la Ta 3-5 °C por debajo del
Tm de los oligonucleótidos.

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La longitud de los oligonucleótidos se define con base en la probabilidad de

encontrar una secuencia igual en un genoma, y tomando en cuenta a los mamíferos
se considera que una longitud de 15 nucleótidos es suficiente para que éste sea
específico en su hibridación. Sin embargo, hay que considerar que la longitud de los
oligonucleótidos también determina la Tm de éstos.

Los cálculos de Tm de los oligonucleótidos que se utilizarán en las reacciones de PCR,

se realizarán utilizando la ecuación:
Tm (°C) = [2(A+T) + 4 (G+C)] – 5
o Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena
complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al
extremo 3’ OH libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucleótidos
se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs).
Estos cuatro componentes son los elementos básicos que son necesarios incorporar
a la reacción para que se complete una PCR. Los pasos básicos son:

1. Desnaturalización (96°): la reacción se calienta bastante para separar, o

desnaturalizar las dos cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena
sencilla para el siguiente paso.

2. Hibridación o “annealing” (55- 65°C°): la reacción se enfría para que los cebadores
puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena
sencilla.

3. Elongación o extensión (72°): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq

polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.

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Curva de
Denaturación inicial Ciclos sucesivos de PCR Extensión final

Para asegurarnos que la amplificación está operando sobre lo que debemos investigar, es
que se utilizan controles de la reacción de PCR, tal como se muestra en siguiente cuadro:

ELECTROFORESIS.
La electroforesis es una técnica analítica de separación de moléculas cargadas
eléctricamente debido a la diferente movilidad que presentan cuando son sometidas a un
campo eléctrico (el sufijo foresis significa "migración" o "movimiento", el prefijo electro nos
dice que estamos utilizando electricidad para hacer que las moléculas migren). Es un
método en biología molecular para analizar y separar fragmentos de ADN (u otras
macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. Las proteínas pueden tener

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carga neta positiva o negativa, los ácidos nucleicos tienen carga neta negativa debido a sus
grupos fosfato, de forma que la carga del ácido nucleico está condicionada por el número
de grupos fosfato.
Durante la electroforesis, el movimiento de las moléculas cargadas se hace a través de una
matriz porosa (o gel), que está inmersa en un medio acuoso. Bajo el campo eléctrico
aplicado, las diferentes moléculas de la muestra se mueven a través de la matriz a diferentes
velocidades, de forma que al final de la electroforesis las distintas moléculas se pueden
diferenciar como bandas separadas a distintas posiciones en la matriz. Dichas bandas se
detectan mediante tinción o autorradiografía, o pueden transferirse a una superficie
membranosa.
De los tipos de electroforesis existentes, la electroforesis en gel de
agarosa es el método más común y más utilizado.

La Estructura de la Agarosa.

La agarosa, producida de un alga marina, es un polisacárido derivado del agar-agar. Es una

matriz tipo gel que es un material poroso, inerte, similar a la gelatina. Durante la
polimerización, los polímeros de agarosa se unen de forma no covalente y forman una red
de paquetes con unas propiedades de filtrado molecular.

En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala
entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la
electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas
correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.
Además, se cargará un marcador de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño
conocido). Estos marcadores nos van a informar que tamaño y que concentración tiene una
banda determinada. se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio.

Cuando el ADN se deposita en los pozos del gel debe mezclarse con un buffer de carga
(Tabla loading buffer) este permite:
1) aumentar la densidad de la muestra para depositarse en el fondo del pozo
2) teñir la muestra para facilitar su carga dentro del gel
3) identificar la distancia recorrida por las muestras:

Los ácidos nucleicos son comúnmente separados en geles de agarosa. La velocidad de

migración del ADN en matrices de agarosa está determinada por los siguientes factores:
• Tamaño molecular del ADN. Las moléculas más grandes migran más lentamente
porque su fricción de arrastre es mayor y porque se mueven a través de los poros
del gel con mayor dificultad que las moléculas pequeñas.

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• Forma o conformación del ADN. El ADN súper-enrollado migra más rápido que el
ADN lineal.
• Concentración de agarosa. Al disminuir la concentración de agarosa, los poros del
gel son más grandes y las moléculas migrarán con mayor velocidad.
• Voltaje aplicado. Con voltajes bajos, la velocidad de migración de los fragmentos
de ADN es proporcional al voltaje aplicado.
• Buffer de electroforesis. La movilidad electroforética del ADN es influenciada por
la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones
(agua desionizada) la conductividad eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente.
En un buffer con una fuerza iónica demasiado alta, la conductividad eléctrica es muy
buena, aún con voltajes moderados y se generan grandes cantidades de calor, lo que
podría fundir el gel y desnaturalizar el ADN.

PROCEDIMIENTO.
Equipo:
✓ Cámara horizontal de electroforesis con los accesorios correspondientes (molde
para hacer el gel, peine, cables para conectar a la fuente de alimentación).
✓ Fuente de alimentación o de poder.
✓ Transiluminador (fuente de luz ultravioleta).
✓ Equipo fotográfico que permita tomar fotos del gel.
✓ Muestras de ADN de diferentes tamaños y formas, a concentraciones conocidas.

Preparación gel de agarosa.

Dependiendo de la longitud de lo amplificado, es que se utilizan distintas concentraciones
de agarosa para construir el gel, como se aprecia en tabla de más abajo.

Preparación del molde. Tomar el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los
topes para que no se salga la agarosa. Después colocar el peine para formar los pocillos
(descripción del proceso disponible en videos), y montar en soporte según imagen.

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Finalmente al leer al transiluminador,

una "línea" de ADN bien definida en
un gel se llama banda. Cada banda
contiene un gran número de
fragmentos de ADN del mismo
tamaño que han viajado juntos a la
misma posición. Un fragmento único
de ADN (o incluso un pequeño grupo
de fragmentos de ADN) no sería
visible por sí mismo en un gel.
Al comparar una banda en una
muestra con el marcador de peso
molecular conocido, podemos
determinar su tamaño aproximado
que permite identificarlo.

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REPORTE DE LABORATORIO N°6:

GENETICA MOLECULAR; PCR Y ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA DE
ÁCIDOS NUCLEICOS

NOMBRE DE LOS INTEGRANTES: …………………………………………………………………………………….

……………………………………………………………………………………………………………………………………….
NRC: …………… CARRERA: …………………………….....................................................................
PROFESORES DE LABORATORIO ………………………………………………………………………………………

I. PREGUNTAS DE DESARROLLO.
1. ¿En base a qué la electroforesis de agarosa separa moléculas?

2. Explicar la migración de acuerdo con la carga de la molécula en estudio.

3. ¿Qué sucedería si se utilizará agua destilada en lugar del Tampón de electroforesis en la

cámara de electroforesis o en la solución del gel de agarosa?

4. ¿El ADN hacia qué electrodo migrará?

5. ¿Por qué la amplificación de ADN es importante?

6. ¿Cuál es la diferencia entre la reacción de PCR y la replicación en células?

7. ¿Cuál es la función de los 4 nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en una

reacción de PCR?

8. ¿Por qué hay 2 diferentes cebadores o “primers”?

EJERCICIO.
En una institución de protección de fauna silvestre han recuperado del cautiverio varias
aves de la familia de las psitácidas o Psittacidae (llamadas comúnmente loros o papagayos,
que incluye a los guacamayos, las cotorras y formas afines de América y África). Para el proceso
de identificación, recuperación y reproducción de las aves, el personal del centro necesita
saber el sexo de estas, sin embargo, no es posible hacerlo fenotípicamente porque esta
especie no presenta dimorfismo sexual (definido como las variaciones en la fisonomía externa,
como forma, coloración o tamaño, entre machos y hembras de una misma especie). Para identificar
el sexo se toma muestra de ADN a partir de la sangre o plumas, de 14 aves y se amplifica
por PCR el gen CHD (El gen CHD encontrado en aves, por ser altamente conservado y además estar
ubicado en cromosomas sexuales es un blanco casi universal para la identificación de sexo en aves).
Los genes CHD alteran la expresión génica posiblemente mediante la modificación de la
estructura de la cromatina, con lo que altera el acceso de la maquinaria transcripcional a
los genes diana.

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Se sabe que los machos tienen cromosomas ZZ (homocigóticos) y las hembras cromosomas
ZW (heterocigóticos), características que generan diferencias en los fragmentos
amplificados del gen CHD pues se conoce que el fragmento derivado del cromosoma W
siempre es más grande que el Z. Así, en los machos se obtiene una sola banda de ADN
amplificado luego de una PCR y en las hembras dos bandas de diferente tamaño
(correspondientes a los fragmentos derivados de Z y W, respectivamente). En la figura se
ilustra el resultado de la PCR:

Secuencia de los partidores para amplificar el gen CHD.

Electroforesis en agarosa de la amplificación por PCR del gen CHD-W Y CHD-Z que permite sexar aves.

Del siguiente resultado responda:

1.- ¿Cuáles son las aves machos y cuales las aves hembra?
2.- ¿Cuál es el sentido del control positivo?
3.- Identifique los posibles errores que se evidencian en la presentación de los resultados.
4.- Basado en la secuencia de los cebadores o primers defina la Tm para una reacción de
PCR.

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