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DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEINAS METODO DE BIURET

En qu consiste la reaccin del Biuret?

El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco.

Reaccin del Biuret Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO 4) se aade a una solucin de protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo de absorcin a 540 nm.

Las caractersticas ms importantes de la reaccin son: La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y protenas. Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composicin de aminocidos. Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.

Violeta-prpura Complejo protena-Cu(II)

El espectrofotmetro que se va a manejar en la prctica es del tipo convencional de haz simple. Un esquema del mismo se presenta a continuacin:

Esquema de un espectrofotmetro convencional de haz simple Se enciende el espectrofotmetro y se ajusta la longitud de onda del espectrofotmetro a 540 nm. Se colocan en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de estar limpios y secos. Se numeran del 1 al 8 con un rotulador permanente al agua.

Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona a cada uno de ellos los volmenes de la disolucin patrn de albmina de suero bovino (BSA) y de agua destilada que se indican en la siguiente Tabla:

Tubo (n) 1 2 3 4 5 6 7 8

Albmina patrn (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0.5 0.6

Agua (mL) 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1.4

Problema (ml)

2.0

A cada uno de los tubos de ensayo se aaden 2 mL de reactivo de Biuret, se tapa con papel parafilm y se invierte dos o tres veces para mezclar Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el bao de agua termostatizado a 37 C, dejndose que se desarrolle el color durante 15 min.

Se enfran los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a temperatura ambiente Se sacan del fregador y se procede a medir en el espectrofotmetro siguiendo las normas expresadas anteriormente.

Se ajusta el cero de absorbancia con la solucin blanco exenta de protena (tubo 1). Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 8. Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio. Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de ensayo con escobilla y jabn. Las marcas de rotulador se eliminan fcilmente por frotacin con el estropajo. Se lava con abundante agua del grifo y se enjuagan los tubos con agua destilada. Se dejan en la gradilla boca abajo hasta el da siguiente para que se sequen. Se calcula la concentracin de protena que se ha colocado en cada uno de los tubos de ensayo.

Como ejemplo: en el ensayo de Biuret, en el tubo 2 se han colocado 0,2 mL de BSA 10 mg/mL y se han diluido a un volumen de 2 mL con agua. Por tanto la concentracin de protena en el tubo ser: (0,2 mL x 10 mg/mL) : 2 mL = 1 mg/mL En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de absorbancia obtenidos frente a la concentracin de protena estndar calculada de cada uno de los tubos, para cada mtodo ensayado. Se ajustan los puntos obtenidos por el mtodo de mnimos cuadrados a una recta, incluyendo el punto 0,0. Se representan la rectas ajustada en el papel milimetrado.

Si la absorbancia de la muestra est dentro del rango de medida del mtodo seleccionado, mediante la ecuacin de la recta de calibrado se puede calcular la concentracin de protena de la disolucin problema