Metodo Lowry VALORACION DE PROTENAS POR EL MTODO DE LOWRY 1.

- FUNDAMENTO TERICO El mtodo de Lowry (1951) es un mtodo espectrofotomtrico de valoracin cuantitativa de protenas. A la disolucin de protenas se le aade un reactivo que forma un complejo coloreado con ellas, siendo la intensidad de color de la disolucin resultante proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer (A= .l.c). La preparacin de las muestras consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas en los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos, formando complejos. Estos complejos Cu 2+protena, de un color azul plido, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponiendo hacia la superficie a los residuos fenolitos de tirosina, que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) En la segunda etapa, el cobre acta como catalizador de la reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por parte de los grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los residuos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Metodo Lowry Reaccin entre la protena y los reactivos de Cu 2.- MATERIAL Y REACTIVOS Materiales .- Tubos de ensayo .- Pipetas y puntas de micropipeta .- Espectrofotmetro .- Cubetas de espectrofotmetro .- Agitadores de tubos .- Timer o cronometro Reactivos - Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M - Reactivo B: CuSO4 5H2O al 0,5% en tartrato sdico-potsico al 2% - Reactivo C: Se mezcla 50 ml del reactivo A con 1 ml de reactivo B al momento de usar. - Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1:1 - Solucin patrn de albmina de suero bovino (11,7 mG/50mL) - Muestra problema huevo o carne 3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Realizacin de la curva de calibrado: Para poder determinar la concentracin de protenas en la muestra problema hay que contar con una curva patrn o de calibrado que relacione la concentracin de albmina presente en cada tubo con la Absorbancia determinada en el espectrofotmetro. Para realizar la curva patrn se toman diferentes volmenes de la solucin patrn de BSA (11,7 mg/50ml) tal y como se detalla en el cuadro, tubos del 1 al 6. El tubo 0, que no contiene protena y s los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del espectrofotmetro cero de absorbancia. Es conveniente procesar simultneamente los tubos de las muestras con la disolucin problema para determinar igualmente su absorbancia. Pasos a seguir: .- Numerar los tubos de plstico de 10 ml, del 1-6 .- Pipetear las cantidades de agua, solucin patrn de albmina y solucin problema de protenas.
2+

y de Folin

Metodo Lowry Tubo Muestr a Agua destilad a g totales Reactivo C 10 a T amb. 0 117g 117g 93.6g 93.6g 70.2g 70,2g 46.8g 46.8g 23.4g 23.4g 11.7g 11.7g 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml Folin diluido 1:1 30 T amb. y oscuro 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l 300 l Abs.750 nm

0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6

0 500 l 500 l 400 l 400 l 300 l 300 l 200 l 200 l 100 l 100 l 50 l 50 l

600 l 100l 100l 200l 200l 300l 300l 400l 400l 500l 500l 550l 550l

.- A continuacin se aade el reactivo de Folin (diluido 1:1) a todos los tubos, mezclando bien. Dejar reposar 30 minutos en oscuridad para que se desarrolle completamente la reaccin coloreada. .- Leer las absorbancias en el espectrofotmetro a 750 nm. Previamente en el aparato se ajusta la absorbancia a cero con el blanco (tubo n 0); de esa forma slo se determina la absorbancia producida por las protenas modificadas, puesto que se resta la absorbancia debida a los reactivos. 4.- TRATAMIENTO Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS 4.1.- Curva patrn: Representar, en papel milimetrado, las absorbancia de los tubos frente a la concentracin de protenas de cada tubo, previamente calculadas. 4.2.- Determinar la concentracin de protenas en la muestra problema, expresando el resultado en mg/ml (tener en cuenta las diluciones realizadas). La concentracin de las muestras problema se determina por interpolacin de los valores de absorbancia en la curva patrn.

Metodo Lowry conclusin: como conclusin las ventajas del mtodo de lowry, son: su alta sensibilidad su fcil operacin fcil de manejar en gran nmero de muestra y las desventajas son: Dependencia del color con la composicin del aminocido Interfieren un buen nmero de compuestos Inestabilidad del reactivo Folin-Ciocalteau a pH alcalino La curva estndar no es lineal para altas concentraciones de protenas por lo tanto es necesario diluir mucho antes de medir