Lowry-1 (Farmacia)

VALORACION DE PROTENAS POR EL MTODO DE LOWRY

1.- FUNDAMENTO TERICO El mtodo de Lowry (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer A= .l.c Este mtodo consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Reaccin entre la protena y los reactivos

BIBLIOGRAFA O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)

Lowry-2 (Farmacia)

2.- MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
.- Tubos de ensayo -.- Tubos Falcon (50 mL) .- Pipetas .- Colormetro .- Cubetas de colormetro .- Agitadores de tubos

Reactivos
- Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M - Reactivo B1: CuSO4 5H2O al 1% - Reactivo B2: tartrato sdico-potsico al 2% - Reactivo C: Se prepara, mezclando los reactivos: A, B1 y B2, en proporciones 50:0,5:0,5 (en volumen) - Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4 - Solucin patrn de albmina de suero bovino (BSA) (2 mg/mL) - Muestra problema 3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Para determinar la concentracin de protenas de la muestra problema se construye una curva patrn o de calibrado a partir de una solucin patrn (BSA) (2 mg/mL). La concentracin que tienen las muestras problema se determina por interpolacin de los valores de absorbancia en la curva patrn. El tubo 0, que slo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del colormetro a cero de absorbancia. Pasos a seguir: a) Numerar del 0 al 6, tubos de plstico de 10 mL b) Pipetear las cantidades de agua, solucin patrn de albmina y solucin problema sealadas en la tabla. c) Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2 d) Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo y dejarlo reposar 15 minutos en oscuridad (dentro de la taquilla). e) A continuacin aadir a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido 1/4), mezclando bien por agitacin. Dejar reposar 30 minutos en la oscuridad para que as se desarrolle completamente la reaccin coloreada. f) Leer las absorbancias en el colormetro a 580 nm. Previamente el aparato se ajusta a Absorbancia=0 con el blanco (tubo n 0); de esa forma slo se mide el color producido por las protenas, puesto que se resta el color debido a los reactivos. Anotar la medida de absorbancia en la tabla. Tubo 0 1 2 3 4 5 6 Agua 1,0 mL 0,9 mL 0,8 mL 0,7 mL 0,6 mL 0,7 mL 0,5 mL Patrn (2 mg/mL) -0,1 mL 0,2 mL 0,3 mL 0,4 mL --problema -----0,3 mL 0,5 mL Reactivo C 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL Folin diluido 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL Abs.580nm [protenas] mg/mL

Lowry-3 (Farmacia)

4.- TRATAMIENTO Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS 4.1.- Determinar la concentracin de protenas de la curva patrn (tubos 1 a 4), expresada en mg/mL, y anotar el resultado en la tabla.

4.2.- Curva patrn: Representar, en papel milimetrado, la absorbancia frente a la concentracin de protenas de los tubos 1 a 4.

4.3.- Determinar la concentracin de protenas de los tubos 5 y 6, expresada en mg/mL.

4.4.- Determinar la concentracin de protenas en la muestra problema, expresada en mg/mL.

5.- CUESTIONES 5.1.- Cmo debera ser la concentracin de protenas de los tubos 5 y 6?. Igual o diferente? Comentarlo.

5.2.- La relacin entre absorbancias y concentracin de protenas se mantiene lineal aunque se incremente mucho la concentracin? Haga un comentario al respecto.

5.3.- Observaciones a la prctica.