Medicina Microbiología Trabajos Prácticos 2022

Trabajo Práctico N° 2: Diagnostico Bacteriano Directo: Coloración de Gram y ZN. Cultivos

bacterianos. Métodos de detección de resistencia antibacteriana. Antibiograma: Pruebas de
sensibilidad cuantitativa y cualitativa Objetivos:

- Conocer el objetivo del diagnóstico bacteriano directo.

- Describir y fundamentar los métodos de diagnóstico directo

INTRODUCCIÓN

El principal objetivo de la microbiología clínica es identificar el agente etiológico de una infección y

determinar la susceptibilidad a determinados antimicrobianos. Para obtener los mejores resultados
clínicos, es necesario tener asociaciones sólidas entre el médico tratante y el especialista técnico de
laboratorio, fomentando una comunicación abierta.

El ciclo diagnóstico de una enfermedad infecciosa inicia con una etapa pre-analítica, en la cual el
médico tratante realiza un diagnóstico presuntivo y solicita la recolección de una muestra para
realizar un diagnóstico microbiológico. Esta etapa es crítica para obtener resultados válidos. Una vez
recibida la muestra en el laboratorio, comienza la etapa analítica o de diagnóstico microbiológico,
en la cual la muestra es procesada mediante diferentes metodologías, obteniéndose un resultado
final. Luego, en la etapa post-analítica, se prepara un informe con el resultado final que es enviado
al médico o al servicio de dónde provino dicha muestra.

Una vez recibida la muestra en el laboratorio, el personal verifica su adecuada calidad, el correcto
transporte y una completa y concordante rotulación entre el sistema de recolección y la orden de
examen. De acuerdo a las políticas establecidas por cada laboratorio, se puede rechazar una muestra
si no cumple con los requisitos previamente establecidos en el manual de toma de muestra;
debiendo notificar al servicio que la envió o al personal responsable. Cuando cumple con todos los
requisitos establecidos, se registra en el sistema informático o libro de registro, iniciándose así la
etapa analítica. Esta etapa de diagnóstico microbiológico puede ser abordada con diversas
estrategias, ya sea realizando una detección directa del agente etiológico a través del diagnóstico
microbiológico directo o mediante el diagnóstico microbiológico indirecto, en el cual se detecta la
respuesta inmune generada por un microorganismo en el hospedero.

El diagnóstico microbiológico directo permite evidenciar directamente el microorganismo o parte

de su estructura en una muestra. Cuando el agente patógeno es recuperado completamente en una
muestra a través del cultivo (diagnóstico directo tradicional), es posible caracterizarlo y conocer su
susceptibilidad antimicrobiana. Sin embargo, en determinadas ocasiones los microorganismos no
son recuperados desde un cultivo o presentan un crecimiento muy lento; en estos casos se utilizan
metodologías aplicadas directamente a la muestra (diagnóstico no tradicional), tales como pruebas
inmunológicas o pruebas basadas en ácidos nucleicos.
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El diagnóstico directo tradicional generalmente abarca tres procedimientos: la observación directa
de la muestra en fresco o sometida a tinciones, su cultivo y la identificación del organismo aislado

COLORACIONES

OBJETIVOS

• Realizar coloraciones: simples, diferenciales.

• Establecer qué tipo de coloración se aplica a los diferentes tipos de muestra.
• Interpretar y evaluar correctamente los resultados obtenidos en las distintas coloraciones y
discernir si la coloración fue bien realizada.

CONTEXTUALIZACIÓN La coloración Gram debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram en

1884. La tinción de Gram aporta dos ideas básicas para la definición de las bacterias: el color que
adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas. En lo relativo a la
coloración tenemos:

- Gram positivos color azul-violeta

- Gram negativos color rojo-rosado

CONCEPTUALIZACIÓN

Coloración Gram

Las bacterias se clasifican en Gram positivas y en Gram negativas de acuerdo a los componentes
químicos de su pared celular. Las Gram positivas poseen una pared celular poco permeable y
resisten la decoloración. Las Gram negativas poseen una pared celular más permeable, se decoloran
y luego adquieren la coloración de la safranina.

La coloración Gram consiste en una técnica de tinción que utiliza 4 componentes: un colorante
básico (cristal violeta), un mordiente (lugol), un decolorante (alcohol cetona) y un colorante de
contraste (safranina).

a. Realización de la extensión

- Producto líquido: Depositar en el centro de un portaobjetos una pequeña cantidad del

producto a examinar y extenderlo con la ayuda de un asa de platino o una pipeta de modo que la
extensión sea lo más fina y homogénea posible. Un producto denso puede ser diluido antes
ligeramente.
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- Cultivo en medio sólido: depositar en un portaobjetos una gotita de agua o solución salina
estéril y disociar en ella una pequeña cantidad de cultivo. Extender para obtener un frotis fino y
homogéneo.

- Sangre: hacer un frotis como para un examen hematológico, depositar sobre el primer tercio
de un portaobjetos limpio y desengrasado una pequeña gotita de sangre. Hacer contactar con la
misma un portaobjetos de bordes esmerilados, que se inclinará 45 °C. La sangre alcanza por
capilaridad todo el borde del portaobjetos que se empujará hacia 15 la parte libre del primer
portaobjetos que contenga la gota de sangre, haciéndolo de un solo movimiento, sin detener ni
volver atrás.
- Órganos: seccionar un pequeño fragmento. Sujetarlo con una pinza, secar el trozo
seccionado sobre un papel secante, haciendo seguidamente con ésta porción una extensión o una
serie de aposiciones, sin apoyar demasiado, de manera que se obtengan preparaciones finas.

b. Secado: dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación calentando ligeramente
con un mechero Bunsen, pero sin calentar jamás brutalmente.

c. Fijación: cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación.

Sólo algunas coloraciones especiales no deben ir precedidas de una fijación. El motivo de la misma
es hacer adherir el frotis al portaobjetos y fijar la morfología de las bacterias, células, por
coagulación rápida de las proteínas. Puede ser por:

- Alcohol flameado: Es la técnica más general. Verter sobre la preparación algunas gotas de
alcohol absoluto. Después de algunos segundos de contacto, escurrir lo mejor posible e
inflamar después el alcohol restante.
- Por el calor: Aplastar la llama de un mechero Bunsen 2 a 3 veces contra la parte inferior de
la preparación, que sujetaremos con unas pinzas. Este método debe rechazarse para los
productos patológicos puesto que altera la morfología de los elementos celulares.
- Por el alcohol en frío: Recubrir la preparación con alcohol etílico absoluto o metílico. Dejar
actuar 1 o 2 minutos. Escurrir y dejar secar.

Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersión (100x) sin usar
cubreobjetos. Depositar sobre el frotis una gota de un aceite especial (aceite de inmersión).
Descender primero el objetivo de 10 x, una vez enfocado pasar al lente de 100 x sumergiéndolo en
la gota, comprobar el enfoque microscópico con el tornillo micrométrico.
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Coloración de Ziehl Neelsen

Es una técnica de tinción diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y
bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono)
que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción
con colorantes básicos. Por esto se denominan Bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR.

Colorante base (fucsina), mordiente (calor), decolorante (alcohol-ácido), colorante de contraste

(azul de metileno).

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la

pared bacteriana que contiene ceras.

Uso: Para identificación de bacilo tuberculoso (Acido alcohol resistente)

Desventaja: Emisión de vapores fenólicos por el calentamiento.

EXAMEN DE LAS PREPARACIONES

Utilice el objetivo de inmersión en aceite (100x): Los bacilos de la tuberculosis (BAAR) son de color
rojo fuerte destacan sobre un fondo azul, tienen forma recta o ligeramente curva, son muy
pequeños (1 - 4µ), frecuentemente granulosos. Se disponen en grupos de 3 a 10 bacilos que
asemejan a trozos de hilos o parecen formar letras torcidas
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CULTIVOS BACTERIANOS

OBJETIVOS

• Conocer la importancia y los diferentes medios de cultivo para el crecimiento bacteriano.

• Realizar tomas de muestras y siembras en medios de cultivo.
• Observación en los medios de cultivo las diferentes colonias bacterianas en crecimiento.

CONTEXTUALIZACIÓN

Con algunas raras excepciones, todo examen bacteriológico incluye el cultivo del producto a
examinar. El cultivo bacteriano tiene tres propósitos principales:

Facilitar el crecimiento y aislamiento de todas las bacterias presentes en una infección.

Determinar cuáles bacterias que se desarrollan es más probable que sean la causa de la
infección y cuáles son contaminantes probables o colonizadores.
Obtener desarrollo suficiente de las bacterias relevantes en clínica para permitir su
identificación y caracterización. Necesario para los estudios complementarios como los de
la sensibilidad de las bacterias a los distintos antibióticos.
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El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismos mediante la toma de bacterias de un
sitio de infección (el ambiente in vivo) por métodos de recolección de muestra y crecimiento en un
ambiente artificial en el laboratorio (el ambiente in vitro).

REQUERIMIENTOS PARA EL DESARROLLO BACTERIANO

Las bacterias pueden ser divididas en autótrofas y heterótrofas. Las primeras comprenden las
bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrógeno de la atmósfera y de la materia
inorgánica simple.

Las bacterias heterótrofas requieren compuestos orgánicos más complejos como fuente de carbono
y nitrógeno, así como proteínas o sus derivados, también requieren carbohidratos y grasas. Este
último grupo de organismos es el más importante en bacteriología médica.

Proteínas. Se suministran generalmente como "peptonas', que se encuentran disponibles, en el

comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas pépticas; consisten en
polipéptidos, dipéptidos y aminoácidos.

Carbohidratos. Suministran carbono para la síntesis, y además su fermentación libera energía

utilizable en el metabolismo.

Factores accesorios de crecimiento. Son también requeridos por algunas bacterias. Entre ellos están
las vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, biotina). Estas suministran
enzimas necesarias que las bacterias son incapaces de sintetizar.
Otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos más complejos,
como el suero, la sangre, la yema de huevo, etc.

Sales minerales. Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. también son requeridos por algunas
bacterias en su desarrollo.

Atmósfera. Algunos microorganismos precisan de una atmósfera con oxígeno para su desarrollo
(aerobios obligados); otros, son incapaces de producirse en presencia de oxígeno libre (anaerobios
obligados) en tanto, que los de un, tercer grupo, aunque pueden crecer en una atmósfera con
oxígeno, logran sobrevivir y crecer sin él (anaerobios facultativos).

Algunos grupos bacterianos, especialmente los gonococos y los neumococos, prefieren una
atmósfera en la que haya una concentración de CO2 de 5 a 10 %.

Presión Osmótica. Las células pueden encogerse y ser destruidas (plasmólisis) en soluciones
hipertónicas; inversamente, se rompen (plasmoptisis) por entrada de agua, en las soluciones
hipotónicas,
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Temperatura. La temperatura en la cual el microorganismo bacteriano crece mejor, es considerada
como temperatura óptima.

Para la mayoría de las bacterias patógenas del hombre es de 37 °C. El desarrollo bacteriano tiene
lugar entre límites de temperatura cuyos extremos son designados como mínimos y máximos. Para
la mayoría de las bacterias patógenas del hombre los límites se encuentran entre 15 y 40°C.

La temperatura en la cual en un tiempo dado mueren las bacterias es conocida como punto término
letal. Las bacterias que son congeladas, no mueren, sino que inhiben su crecimiento. Los
microorganismos importantes en bacteriología médica son generalmente mesofílicos (límites entre
5 y 43°C).

Sin embargo, hay microorganismos que pululan entre límites de temperatura mucho más bajas
(psicrofílicos), o bien, superiores (termofílicos). Los primeros son encontrados en el suero y en el
agua fría, los últimos en la materia orgánica en fermentación.

Luz. La mayoría de las bacterias se desarrollan mejor en ausencia de luz. La luz del sol, con su
componente ultravioleta, puede incluso ser letal.

pH. La mayoría de las bacterias crecen mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7.2 a 7.6), pero
existe también un límite de potencialidad bastante amplio. Los hongos crecen con facilidad en
medios ácidos (pH 5) mientras que el medio especial para el crecimiento del Vibrio cholerae debe
ser marcadamente alcalino (pH 9.6)

Componentes de un medio de cultivo

De una forma muy general, se puede decir que los medios de cultivo se componen de:
• Una fuente de carbono. Normalmente son azúcares sencillos como, por ejemplo, glucosa,
lactosa, etc., pero existen también algunos organismos que usan CO2 (en este caso serían
autótrofos, al igual que las plantas).
• Una fuente de nitrógeno. Se suelen usar proteínas parcialmente hidrolizadas, peptonas.
• Otros componentes, como Na+, K+, vitaminas, etc.
• Amortiguadores de pH (soluciones tampón o buffer). Son sustancias que ayudan a mantener
el pH del medio de cultivo dentro de un rango adecuado para el crecimiento de los
microorganismos. Por ejemplo, suelen usarse como tampones los fosfatos disódicos
(Na2HPO4) o monosódicos (NaH2PO4).

Existen preparados comerciales (infusiones o extractos) obtenidos a partir de tejidos animales como
cerebro, corazón o hígado. Y a veces se usan también fluidos corporales como la sangre animal.
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Todos estos productos contienen los componentes básicos necesarios para el crecimiento de
microorganismos.

Es importante tener en cuenta que hay ciertos tipos de microorganismos con requerimientos
especiales para su desarrollo, que se añadirán al medio en caso necesario.
Un componente importante que permite elaborar medios de cultivo sólidos es el agar, un
polisacárido procedente de algas marinas que tiene la particularidad de fundirse en torno a 100 ºC
y gelificar alrededor de 40 ºC. Si se tiene en cuenta que los microorganismos cultivados en clínica
crecen en torno a 37 ºC, es necesario que el agente gelificante se mantenga sólido a esa
temperatura. Otra ventaja que ha hecho del agar el gelificante más adecuado en el cultivo de
microorganismos es el escaso número de organismos que tienen capacidad para degradarlo.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

De acuerdo a su consistencia

Líquidos (caldos): Utilizados generalmente para obtener crecimiento rápido y masivo; en estos
medios las bacterias conservan su forma original y características.

Semisólidos: Útiles para investigar movilidad y conservar las bacterias por períodos largos, contienen
de 1-1.5% de agar

Sólidos: Especialmente útiles para el aislamiento de bacterias y observación de colonias, contienen

de 2 a 3 % de agar

El formato en el que se presentan los medios de cultivo puede ser:

• Sólido en placas. Son medios con agar envasados en placas de Petri.
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• Sólido en tubo. En este caso suele ser agar inclinado (se deja enfriar en esta posición para
que la superficie del medio sea mayor).
• Líquido en tubo como, por ejemplo, agua de peptona.
• Semisólido en tubo como, por ejemplo, caldo de tioglicolato.

¿Por qué existen diferentes formatos de medios de cultivo?

En los medios de cultivo sólidos, los microorganismos crecen sobre la superficie; esto permite la
formación de colonias aisladas, un paso fundamental para la identificación microbiana. Al mismo
tiempo, este tipo de medios permite un fácil acceso al microorganismo para una posterior
manipulación. Si el objetivo del cultivo es simplemente la multiplicación del microorganismo, se
suelen utilizar cultivos líquidos. A continuación se citan algunos ejemplos sobre qué formato es el
más adecuado en cada caso:
• Para aislar colonias: medio sólido en placa.
• Para conservar un cultivo durante un periodo de tiempo largo: agar inclinado (sólido en tubo). En
este formato los microorganismos tienen mayor disponibilidad de nutrientes.
• Para detección del crecimiento microbiano: medios líquidos.

CLASIFICACIÓN Y FUNCIONES DE LOS MEDIOS

Los medios se clasifican de acuerdo con su función y uso.

En el diagnóstico bacteriológico hay cuatro categorías generales de medios: enriquecimiento,

apoyo, selectivo y diferencial.

Los medios de enriquecimiento contienen nutrientes específicos requeridos para el desarrollo de

determinados patógenos bacterianos que pueden estar presentes solos o con otras especies
bacterianas en una muestra del paciente. Este tipo de medios se utiliza para favorecer el desarrollo
de un determinado patógeno bacteriano, a partir de una mezcla de microorganismos, por el uso de
especificidad de nutrientes. Un ejemplo de estos medios es el agar amortiguado con carbón y
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extracto de levadura que proporciona L-cisteína y otros nutrientes necesarios para el crecimiento
necesario de Legionella pneumófila, el agente etiológico de la enfermedad de los legionarios.

Los medios de apoyo o universales contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la mayoría
de los microorganismos sin requerimientos especiales y sin brindar ventaja alguna en el crecimiento
de un microorganismo en particular.

Los medios selectivos contienen uno o más agentes que inhiben todos los microorganismos excepto
los que son buscados. En otras palabras, estos medios seleccionan el crecimiento de ciertas
bacterias e inhiben el de otras. Los agentes inhibidores utilizados para este propósito son colorantes,
sales biliares, alcoholes, ácidos y antibióticos. Un ejemplo es el agar con alcohol feniletílico, que
inhibe el desarrollo de bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos, y permite el
crecimiento de cocos Gram positivos.

Los medios diferenciales emplean un factor (o factores) que permite que las colonias de una especie
o tipo bacteriano exhiban ciertas características metabólicas o de cultivos que pueden utilizarse para
diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar placa.

Medios de transporte: En algunas circunstancias puede haber una demora entre la extracción de
una muestra y su cultivo. Muchos microorganismos pierden su viabilidad cuando se almacenan en
medios ordinarios de laboratorios. Se dispone de varios medios de transporte, que consisten en
agentes reductores como el tioglicolato o la cisteina en cierto número de tipos de medios salinos
altamente amortiguados (buffered). Un ejemplo de medio de transporte es el medio de Stuart. Se
utiliza en una unidad descartable de cultivo, denominado Culturette, que consiste en un tapón
estéril de poliestireno y una ampolla del medio de Stuart.

Después de recoger la muestra, se coloca en el tubo y se aplasta la ampolla para liberar el medio
alrededor del extremo de tapón. Este tipo de medio no es adecuado para aislar anaerobios sensibles
al oxígeno. Es importante destacar que muchos medios utilizados en el diagnóstico bacteriológico
cumplen más de una función. Por ejemplo, el agar MacConkey es tanto diferencial como selectivo,
debido a que inhibe el desarrollo de la mayoría de las bacterias grampositivas.
Otro ejemplo es el agar sangre de carnero. Éste es el medio de apoyo más común utilizado en el
diagnóstico bacteriológico, debido a que permite el desarrollo de muchos microorganismos. Sin
embargo, en muchos casos este agar es también diferencial, porque la apariencia de las colonias
producidas por ciertas especies bacterianas es muy diferente.
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FACTORES DETERMINANTES EN LA PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO

Los factores siguientes son importantes en la preparación de un medio de cultivo:

1. Fluidez: El medio deshidratado comercialmente disponible o la mezcla del propio

microbiólogo se disuelve en primer término en agua. Si se requiere un medio sólido, se agrega agar.

2. pH: Se verifica el pH del medio y se regula si es preciso. En preparaciones comerciales no

suele ser necesario el ajuste. Para amortiguar los propios medios sintéticos se utilizan generalmente
buffers de fosfato, porque el crecimiento óptimo de la mayor parte de las bacterias se encuentran
en el intervalo de amortiguación de los iones fosfato: 6.6 a 7.2.

3. Esterilización: Se debe esterilizar el medio. Este procedimiento asegura la destrucción de

todos los microorganismos no deseados que están presentes durante su preparación. Si los
componentes del medio son estables al calor se lleva a cabo la esterilización en una autoclave (121°C
durante 15 minutos). Si se requiere sangre y ciertos componentes inestables, como antibióticos o
compuestos oxidables al calor en el medio, se los debe esterilizar por separado mediante filtración
u otros procesos, y luego se agregan al medio esterilizado cuando éste se enfría hasta una
temperatura de 50°C.

Referencias https://www.sintesis.com/data/indices/9788490773185.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Morfolog%C3%A
Da_y_Tinci%C3%B3n.pdf
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http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/microparamedicina/wp-
content/uploads/2016/03/TRABAJOPRACTICO-N%C2%B0-2.pdf
https://editorial.unam.edu.ar/images/documentos_digitales/e17_978-950-579-160-6.pdf