PRINCIPIOS

GENERALES DEL
DIAGNÓSTICO DE
LABORATORIO
DRA. CARINA HUANCA ENCINAS
PRINCIPIOS GENERALES DEL DIAGNÓSTICO DE
LABORATORIO

• Microscopía y cultivo in vitro.

• Diagnóstico molecular.
• Diagnóstico serológico.
diagnóstico microbiológico

Es el conjunto de procedimientos y técnicas complementarias

empleadas para establecer la etiología del agente responsable de
una enfermedad infecciosa y poder así proceder a su tratamiento y
a tomar, en caso de que fuera necesario, las medidas
correspondientes para evitar la diseminación del patógeno. Para
llevarlo a cabo, se parte de la información acumulada por el médico
y que se recoge en la historia clínica del paciente en forma de
síntomas, signos y diagnóstico clínico más probable a su entender. El
diagnóstico microbiológico en bacteriología puede clasificarse en
distintos tipos:
• Directos:
Implican la demostración del agente patógeno, sus metabolitos o
alguno de sus componentes antigénicos en los fluidos orgánicos del
paciente.

• Indirectos:
Implican la demostración de la huella que el agente patógeno ha
dejado en su contacto con el sistema inmunocompetente del
paciente. A la hora de llevar a cabo la identificación es
imprescindible la labor del laboratorio, que nos aportará datos
preliminares o definitivos sobre los agentes patológicos causantes de
la afección. Para ello, se lleva a término un procedimiento ordenado
que comprende:
• 1.- Toma de muestras (esputo, sangre, heces, orina, tejido, LCR,
etc) que dependerán de la sospecha de procedencia de la
afección.
• 2.- Observación al microscopio, si procede, de la muestra (fresco,
coloración )
• 3.- Cultivo: Obtención de colonias aisladas.
• 4.- Identificación del género y de la especie mediante test
bioquímicos, genéticos, inmunológicos.
• 5.- Test de sensibilidad (punto de corte, MIC)
A la hora de tomar las muestras microbiológicas, debemos de
hacerlo con el mayor rigor posible, siendo para ello muy importante
el cumplimiento de los siguientes requisitos que permitirán
garantizar el resultado correcto del estudio:

1. Elegir el material que refleje el proceso patológico.

2. Evitar contaminación con la flora del paciente.
3. Obtener volumen suficiente para observación microscópica y
cultivo.
4. Obtener la muestra, si es posible, antes de iniciar la terapia
antimicrobiana.
5. Transportar la muestra rápidamente al laboratorio.
• Las muestras deben ser identificadas con una etiqueta adherida al
envase y los datos anotados deben coincidir exactamente con los
de la solicitud de examen dado por el médico tratante. Una vez
tenemos las muestras adecuadas, podemos comenzar a realizar las
técnicas diagnósticas correspondientes. Dentro del diagnóstico
microbiológico incluiremos:
Métodos Directos:

•  Observación microscópica
•  Cultivo e Identificación
•  Técnicas Inmunológicas: inmunofluorescencia, aglutinación,
ELISA
•  Técnicas moleculares: hibridación – molecular (PCR)
Examen microscópico (fresco, tinción):

La visualización de los microorganismos patógenos es la técnica más

evidente. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y a la similitud
estructural existente entre algunos de ellos, se generan numerosas
complicaciones. Para evitar el problema del tamaño, se utilizan
sistemas de ampliación de imagen como microscopios. Las tinciones
diferenciales y específicas, nos permitirán paliar el problema de la
similitud.
Habitualmente, la visión microscópica de los agentes patógenos no
nos ofrecerá un diagnóstico definitivo, sino una orientación
diagnóstica.
• Los microscopios ópticos permiten ver bacterias, hongos y
protozoos. Para ver virus es necesaria una resolución mucho mayor
que sólo alcanza el microscopio electrónico.
Tinción de gran :

• A pesar de que fue desarrollada en el siglo XIX la tinción de gram

es la más utilizada en el diagnóstico microbiológico. De tal modo
que la información que ofrece de la composición de la pared
bacteriana es la base de todas las clasificaciones en este reino
• Se trata de una tinción diferencial que distingue entre bacterias
con pared gruesa (gram positivas= teñidas de violeta) y bacterias
con pared fina y membrana externa (gram negativas= tiñe de
rojo).
• Sin embargo, no todas las bacterias se tiñen mediante esta
técnica, ya que hay algunas que son resistentes a ella, como las
que se nombran a continuación:- Mycobacterias, ya que están
encapsuladas- Mycoplasmas, porque no tienen pared - Formas L,
por la pérdida ocasional de la pared
Tinción de Ziehl-Neelsen:

• También es una tinción diferencial. Se denomina tinción

ácidoalcohol resistente y es específica para unas bacterias con
estructura de pared única, las micobacterias. La pared de las
micobacterias no está basada en peptidoglicano como las bacterias
gram positivas y gram negativas, sino en ácidos micólicos. Esta
particularidad las hace resistentes a la decoloración con ácido y
alcohol que no se produce en casi ningún otro tipo bacteriano. La
tinción de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante
primario es la fucsina que tiñe toda la preparación de rojo
brillante.
• Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el
colorante. La solución decolorante elimina el colorante primario
excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes. (BAAR). Por último
el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación. Esta
tinción es útil en la detección de bacterias del género
Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos
rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de
tuberculosis
Crecimientos en cultivos e identificación:

• Denominamos cultivo al proceso de laboratorio por el que se

induce el crecimiento cuantitativo de los agentes patógenos. Para
conseguir su crecimiento de manera artificial es necesario un
aporte nutritivo suficiente así como las condiciones físicas
adecuadas para su desarrollo. Para ello se utilizan los medios de
cultivo. Por lo general, todos los microorganismos necesitan unos
elementos imprescindibles que incluyen fuentes de energía, de
carbono, algunas sales y elementos y por supuesto agua. Algunos
requieren además otras sustancias adicionales como vitaminas o
aminoácidos esenciales para cada especie.
• Al igual que ocurre con su nutrición, no todos necesitan las mismas
condiciones físicas para crecer, por lo que hay que individualizar
la temperatura, la humedad, el pH y otras características si
queremos que nuestros cultivos salgan adelante. En los
laboratorios de microbiología podemos encontrar medios de
cultivo líquidos y sólidos.
Inmunofluorescencia directa (ID):

• Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el

laboratorio clínico. El principio básico de la inmunofluorescencia
directa . Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas
sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan
anticuerpos específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína
que difunden a través de la membrana celular y se combinan con
los antígenos (Ag) . La reacción antígeno anticuerpo (Ag-Ac) se
visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de
fluorescencia de color verde manzana.
• Sin embargo la realización de la reacción es laboriosa, depende
mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de
fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un
diagnóstico certero, así como una recolección y preparación de la
muestra adecuada. Aun así, el método, en manos de una persona
con experiencia resulta útil para la identificación, ya que nos
proporciona un diagnóstico etiológico en el curso de una jornada
de trabajo. Además puede estudiar varias muestras
simultáneamente.
TEST DE AGLUTINACION

• El test de aglutinación es un método simple, de un solo paso, que

a veces se usa para la detección de antígenos en muestras clínicas.
Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de
anticuerpos específicos sobre eritrocitos o partículas de látex.
Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se
investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno
adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se
complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido
al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas.
TEST DE AGLUTINACION
ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA)

• Los EIA para la detección de antígeno se basan habitualmente en la

captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase
sólida, en general el pocillo de una microplaca o una pequeña esfera
de plástico. El antígeno presente en la muestra clínica se combina
con el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno se detecta
mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una
enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa
alcalina. El substrato para esas enzimas varía. En la reacción con la
peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto
químico incoloro que en su forma oxidada tiene un color
característico
• Por esta técnica se puede procesar gran número de muestras en
forma rápida y automatizada, no requiriendo de un observador
experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por
medio de espectrofotómetros especialmente diseñados (lectores
de ELISA) , siendo entonces una técnica más objetiva.
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)

• Una nueva técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa

(PCR), para incrementar el número de moléculas de DNA blanco en
las muestras. La técnica consiste en la detección de
microorganismos. Recordemos que cuenta con su propio acido
nucleido, lo que permite distinguirlos a través de un fragmento de
acido nucleido sintetizado y marcado, denominado SONDA, que posee
una secuencia complementaria a las secuencias especificas
buscadas . Esta sonda además puede ser marcada con sustancias
radioactivas, fluorescentes u otros marcadores. Tiene una
sensibilidad tan alta que puede amplificar una única molécula de
DNA y una sola copia de genes puede ser extraída.
B. Métodos indirectos:

• Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por

parte del huésped: . Detección de anticuerpos específicos por técnicas
inmunológicas (EIA, IFI, WB, etc.). Producción de anticuerpos in vitro.
Evidencia indirecta del crecimiento, en lugar de buscar el antígeno
busca el anticuerpo (AC) la huella inmunológica que el agente
microbiano dejo en el organism.
• En el curso de una infección varían las poblaciones de anticuerpos frente
al agente infectante. En una primera fase la clase predominante suele
ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM disminuyen
hasta desaparecer o quedar a baja concentración residual y, en cambio,
aumentan las IgG.
• La búsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad para hacer
diagnóstico de infección reciente en una sola muestra de suero
extraída en el período agudo de la enfermedad.

• La seroconversión es el aumento del título de anticuerpos cuatro

veces o más observado en dos muestras pareadas de suero. La
primera muestra se obtendrá en el período agudo de la
enfermedad y la segunda, 15 a 21 días después de la primera, en
el período de convalesencia. La seroconversión es útil para
establecer el diagnóstico retrospectivo, pero no para el
diagnóstico temprano de una infección, puesto que debemos
esperar al período de convalecencia para obtener la segunda
muestra del suero.
Métodos: -

• I.F.I –
• ELISA
• indirecta Inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una variante de IF
que mide la cantidad de anticuerpo en una muestra
WESTERN BLOT (WB)

• Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot están encontrando

amplias aplicaciones en el diagnóstico virológico. Son
particularmente útiles para el diagnóstico del HIV. La técnica de
WB se basa en la separación electroforética de proteínas virales
que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa
con el objeto de determinar la presencia de anticuerpos
específicos contra cada una de esas proteínas.
Test de sensibilidad:

• 3.- Test de sensibilidad: Pruebas de sensibilidad Antimicrobiana:

para bacterias El antibiograma es la prueba microbiológica que se
realiza para determinar la sensibilidad de una colonia bacteriana a
un antibiótico o grupo de antibióticos. El antibiograma, una vez
realizado, da la siguiente información: • Grado de sensibilidad de
la colonia bacteriana a un determinado antibiótico. • Diferencia
de sensibilidad por parte de la colonia a diferentes antibióticos. •
Con esta información, se clasifica el efecto del antibiótico sobre
esa determinada colonia en: Resistente (R), Intermedio (I) y
Sensible (S).
• En el ámbito clínico, el estudio sobre la bacteria causante de la
infección y sobre el antibiograma es entregado al médico
responsable del paciente. Este último es quien se encarga de
decidir el tipo de antibiótico adecuado, dependiendo de los
resultados del antibiograma y de otros factores procedentes del
paciente, como por ejemplo alergia a la penicilina
• La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se
evalúa habitualmente mediante algunas de las variantes de los
métodos de dilución. La Concentración Mínima Inhibitoria (CIM) se
define como la mínima concentración de antimicrobiano (en
μg/mL) que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo
después de 24 horas de incubación a 37°C. La CMI se ha
establecido como "gold Standard" frente a otros métodos que
evalúan susceptibilidad antimicrobiana; además de confirmar
resistencias inusuales, da respuestas definitivas cuando el
resultado obtenido por otros métodos es indeterminado
• La Concentración Mínima Bactericida (CBM), se define como la
mínima concentración de antimicrobiano que elimina a más del
99,9% de los microorganismos viables después de un tiempo
determinado de incubación (generalmente 24 horas) (8,9). En
ocasiones se hace necesario determinar la actividad bactericida de
un agente antimicrobiano, como es el caso de endocarditis,
osteomielitis, meningitis o infecciones en pacientes
inmunosuprimidos, existe la necesidad de establecer métodos de
laboratorio que definan la actividad de estos agentes
• Pruebas de sensibilidad a antifúngicos tienen como objetivo
conocer si los microorganismos ensayados son sensibles o
resistentes a los antifungico y sirven para elegir de forma óptima
el tratamiento .