M11.

Proyecto de síntesis 22-23

O VIII
ET
R

“PNT: UROCULTIVO"

Lidia Cortés, Aina González, Natalia Molina y Noelia Núñez

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01 Objetivo 3

02 05 Introducción 3

03 Material 4

04 Cultivo 5

05 05 Incubación 5

Índice
06 Aislamiento 5

07
Pruebas bioquímicas 7

08 05
Antibiograma 12

Bibliografía 13
09

05
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1.Objetivo:
Aislar, cuantificar y permitir la identificación presuntiva y la diferenciación de los
principales microorganismos causantes de infecciones del tracto urinario.

2. Introducción:
La orina es normalmente un fluido corporal estéril. Sin embargo, se contamina
fácilmente con microbiota procedente del perineo, la próstata, la uretra externa o la
vagina. La infección urinaria es el resultado de la multiplicación de estas bacterias en
una o varias estructuras del tracto urinario, con la consiguiente invasión de los tejidos.

Los estudios epidemiológicos han demostrado que los recuentos bacterianos están
asociados a las infecciones bacterianas de las vías urinarias. La importancia de los
recuentos bacterianos depende de la forma de presentación de la enfermedad; a
menudo se utilizan diferentes criterios para determinar si el recuento de bacterias en la
orina es significativo y requiere tratamiento.

La infección urinaria aguda (ITU) es frecuente, sobre todo en mujeres en edad fértil.
Aproximadamente el 85% de los episodios se deben al bacilo gramnegativos
Escherichia coli, un 10% a otros bacilos gramnegativos como Klebsiella pneumoniae,
S. Saprophyticus, Proteus mirabilis y Enterobacter, Enterococcus faecalis. Entre
otros bacilos gramnegativos hay que destacar Pseudomonas aeruginosa. Las
bacteterias grampositivas, que son menos frecuentes, Streptococcus agalactiae o
Corynebacterium urealyticum.

La ITU en niños y varones suele complicarse y ser consecuencia de una anomalía del
tracto urinario. El diagnóstico y tratamiento rápidos de la ITU en niños es esencial para
prevenir la cicatrización renal. La incidencia de ITU en ambos sexos aumenta con la
edad. La bacteriuria asintomática se observa con frecuencia en pacientes
embarazadas y también en ancianos.

Imagen 1: Epidemiología de las infecciones urinarias.

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3.Material y reactivos:
Material:
Fungible: No fungible
Puntas de micropipeta Agua destilada
Pipeta Asa de siembra
Tubos de ensayo
Portaobjetos
Micropipeta
Algodón
Alcohol etílico al 70%

Aparatos:
Estufa de cultivo
Mechero Bunsen
Microscopio óptico

Medios de cultivo:
Agar sangre
Agar Mc.Conkey
Agar Cled
Api 20E
Mueller Hinton
Agar bilis esculina

Reactivos:
Tinción de Gram:
Cristal violeta
Lugol
Alcohol:acetona 70:30
Safranina
Oxidasa:
Reactivo de Kovacs
Api 20E
SSF 1%NaCl
Catalasa:
Agua oxigenada
Bacitracina y Novobiocina:
Disco de antibiograma con bacitracina
Coagulasa:
Plasma de conejo liofilizado
Tolerancia al NaCl:
Cloruro de Sodio al 6,5%

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El cultivo de orina se utiliza, junto con los resultados de un análisis de orina, para
diagnosticar una ITU e identificar las bacterias causantes de la infección. Si el
urocultivo es positivo, pueden realizarse pruebas de susceptibilidad (antibiograma) para
determinar qué antibióticos inhibirán el crecimiento del microbio causante de la
infección. Los resultados ayudarán al médico a determinar qué fármacos pueden ser
más eficaces para tratar la infección.

4.Cultivo:
a) Cuantitativo:
Introducir el asa calibrada de forma
vertical en la muestra de orina y
retirar.
Sembrar por estría vertical:
depositar 0,1 ml. de la dilución 1/50
sobre la superficie de una placa de
medio CLED. Con el asa se siembra
trazar una línea de arriba hacia
abajo y a partir de esta esparcir
repetidamente hacia la derecha y
hacia la izquierda, hasta cubrir la
totalidad de la placa.
a) Cualitativo:
Introducir el asa de forma vertical en
la muestra de orina y retirar.
Sembrar por estría: depositar 0,1 ml.
de la dilución 1/50 sobre la
superficie de una placa de agar
MacConkey o agar sangre y realizar
una estría a través del centro del
agar. Luego extender el inóculo en
ángulos rectos respecto a la estría
primaria. A continuación, la placa se
gira 90º y el inóculo se extiende
hasta cubrir toda la superficie.

No es correcto efectuar una

identificación directa a partir de
las características coloniales y de
fermentación de la lactosa en
estos medios.

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5. Incubación
Para placas de Agar sangre: en atmósfera enriquecida con CO2 y 5%, en anaerobiosis.
Para placas de Agar Cled o MC. Conkey: en atmósfera ambiental aerobiosis.
Incubar las placas a 35-37º durante 18-24 horas.

6. Aislamiento
A partir de la colonia crecida en agar sangre o MC. Conkey sembrar para asilamiento
por siembra en estría. Mediante la utilización de la tinción de Gram se visualiza y
precisa la morfología de las bacterias aisladas mediante el cultivo, para decidir las
pruebas a realizar para la identificación definitiva.

Una vez aislado el agente causante se procede a su identificación mediante una serie
de pruebas bioquímicas.

-
Para realizar la tinción de Gram:

Depositar una gota de suspensión de la muestra en un portaobjetos.

Hacer movimientos circulares o en zigzag zag por encima de la llama del mechero
bunsen hasta que la muestra quede totalmente seca y fijada.
Aplicar el colorante cristal violeta durante 1 minuto y lavar con agua destilada.
Añadir lugol justo por encima de la zona de la muestra, esperar durante 1 minuto y
lavar con agua destilada.
Añadir alcohol 96º, dejar que vaya resbalando durante 15 segundos y aclarar con
agua destilada.
Aplicar el colorante safranina, dejar actuar durante 1 minuto y aclarar con agua
destilada
Dejar secar y posteriormente observar la muestra en el microscopio óptico.

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7. Pruebas bioquímicas:
Estas se realizan a partir de un cultivo puro obtenido de colonias aisladas en medios
inhibidores
Si se observan BGN , se realiza:
a) Oxidasa:
Procedimiento:
1.Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.
2.Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
3.Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.

Resultado:
+ Cambio de color a púrpura y negro en 10-20 segundos.
- No cambio de color: familia Enterobacteriaceae.

Posteriormente realizar aislamiento en agar Mc.Conkey y siembra en API 20E.

b) API 20E:

Cada microtubo nos dará un resultado y este es el que nos ayudará a identificar la muestra.

Del conjunto de reacciones se obtendrá un perfil numérico. Los pocillos están divididos e
grupos de tres. En total hay 7 tripletes y a cada microtubo se le da un valor según
corresponda al resultado (0,1,2 o 4).

Reacción negativa: número 0.

Reacción positiva:
número 1 (primer pocillo de un triplete).
número 2 (segundo pocillo de un triplete).
número 4 (tercer pocillo de un triplete).

Finalmente se sumarán los valores de cada triplete y se obtendrá un código de 7 cifras.

Este código se busca en el sitio web del fabricante y se nos proporciona el
microorganismo más coincidente con nuestros resultados.

Imagen 2: API (Analytical Profile Index) 20E. Panel bioquímico para la identificación y
diferenciación de miembros de la familia Enterobacteriaceae. En la imagen se muestran todos los
resultados positivos.

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Para la preparación del inóculo hay que tomar la colonia

bien aislada y resuspenderla homogéneamente en 5 mL de
solución salina fisiológica (1%NaCl). En caso de tener la
muestra resuspendida en un medio líquido es suficiente con
inocular esa propia solución en cada uno de los pocillos.

Los pocillos están formados por un tubo y una cápsula.

Cada pocillo corresponde a una prueba bioquímica

diferente, y según la prueba existen diferentes
especificacIones.

Llenar el tubo y la cápsula de los pocillos con la

suspensión de bacterias

Llenar los tubos, no la cúpula, con la suspensión Los demás pocillos

de bacterias

Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos

Incubar a 37ºC durante 24 horas y hacer la lectura de la

galería de pruebas bioquímicas para el diagnostico del
genero y especie en muchos casos.

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En caso de ser CGP, se procede a realizar las pruebas bioquímicas para la

identificación del género y posteriormente de la especie:

Númº1 Catalasa

1.Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con

ayuda de una pipeta Pasteur.
Proceso
2. Suspender la bacteria
3.Detectar la formación de burbujas

+ Formación inmediata de burbujas: se procede a realizar la prueba

de bacitracina (I) (prueba númº2).
Resultados
- No formación de burbujas: siembra en agar sangre para visualizar el
tipo de hemólisis que realiza.

Númº2 Bacitracina (I)

1.Realizar una suspensión del microorganismo en estudio (de turbidez

igual a la del estandard 0.5 de la escala de Mac Farland).
2.Mediante la técnica de siembra en superficie, inocular el
Proceso
microorganismo en estudio en una placa de Agar Sangre.
3.Colocar un disco de Bacitracina sobre la superficie del agar.
4.Incubar a 37°C durante 18-24 horas.

S Presencia de halo de inhibición: Micrococcaceae (sin importancia

clínica para urocultivo).
Resultados
R Ausencia de halo de inhibición: se procede a realizar la prueba de
la coagulasa (prueba númº3).

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Númº3 Coagulasa

1.Emulsionar colonias en un tubo de ensayo con 0,5ml de plasma

citratado. Este es de conejo y viene liofilizado, por lo que habrá que
prepararlo siguiendo las instrucciones del fabricante.
Proceso
2.Incubar a 37ºC y observar la formación del coágulo a las 4 horas. Si
es negativo, reincubar toda la noche y proceder a su lectura a las 18 –
24 horas.

+ Formación de coágulo: S.aureus (sin importancia clínica para

urocultivo).
Resultados
- No formación de coágulo:
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se procede a realizar la prueba de la
novobiocina (prueba númº4).

Númº4 Novobiocina

1.Realizar una suspensión del microorganismo en estudio (de turbidez

igual a la del estandard 0.5 de la escala de Mac Farland).
2.Mediante la técnica de siembra en superficie, inocular el
Proceso
microorganismo en estudio en una placa de Mueller Hinton.
3.Colocar un disco de Novobiocina sobre la superficie del agar.
4.Incubar a 37°C durante 18-24 horas.

S Presencia de halo de inhibición: S.epidermidis (sin importancia

Resultados clínica para urocultivo).
R Ausencia de halo de inhibición: S.saprophyticus.

Númº5 Hemòlisis

1.Realizar una siembra del cultivo puro mediante la técnica del

agotamiento de asa en una placa de agar sangre.
Proceso 2.Tras 24 horas de incubación observar la presencia de halos de
hemólisis alrededor de las colonias e identificar el tipo de hemólisis que
realiza nuestro microorganismo.

β hemólisis total y halo totalmente transparente: se procede a realizar

la prueba de la bacitracina (II) (númº 6).
Resultados α Hemólisis parcial y halo de color verdoso.
γ No aparición de hemólisis, sin halo alrededor de la colonia.
*Si es α o γ se procede a realizar la prueba de la Bilis-Esculina (númº7).

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Númº6 Bacitracina (II)

1.Realizar una suspensión del microorganismo en estudio (de turbidez

igual a la del estandard 0.5 de la escala de Mac Farland).
2.Mediante la técnica de siembra en superficie, inocular el
Proceso
microorganismo en estudio en una placa de Agar Sangre.
3.Colocar un disco de Bacitracina sobre la superficie del agar.
4.Incubar a 37°C durante 18-24 horas.

S Presencia de halo de inhibición: S.pyogenes (sin importancia clínica

Resultados para urocultivo).
R Ausencia de halo de inhibición: S.agalactiae

Númº7 Bilis-Esculina

1.Sembrar en superficie, en tubos que contienen el medio de agar bilis

Proceso esculina inclinado (en “pico de flauta”).
2.Incubar de 24-48 horas a 37ªC

+ Se observa un oscurecimiento o ennegrecimiento del medio de

cultivo: se procede a realizar la prueba de tolerancia a las sales
Resultados (númº8).
- Ausencia de oscurecimiento del medio de cultivo: Streptococcus (sin
importancia clínica para urocultivo).

Númº8 Tolerancia al NaCl

1.Tomar 2 ó 3 colonias de un cultivo puro.

2.Hacer una suspensión homogénea en un tubo con caldo nutritivo con
Proceso
6.5% de NaCl.
3.Incubar durante 24 horas a 35-37°C.

+
Resultados
- Se observa crecimiento: Enterococcus.
No hay crecimiento: Streptococcus del grupo D no Enterococcus.

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8. Antibiograma
Metodología:
Seleccionar 3 – 5 colonias de la misma morfología.
Transferir las colonias con un hisopo en solución fisiológica 0,9%.
Con el patrón de turbidez = escala de MC. Farland (1.5 108 UFC/m. Equivalente al
tubo 5 de la escala de MC. Farland).
Estandarizar la suspensión del inóculo y homogenizar, introduciendo el isopo estéril
en la suspensión.
Sembrar suavemente en la superficie del medio (Mueller Hinton), con una
distribución homogénea del inóculo.
Colocar la tapa en la placa de Petri y dejar secar el inóculo de 3 a 5 minutos.
Sacar los antibióticos dos horas de ser utilizados.
Colocar los discos con unas pinzas estériles sobre la superficie del agar y presionar
ligeramente sobre el disco para que no se despegue.
La distancia entre disco y disco debe ser de 30mm cm. Y de disco al borde de la
placa de Petri de 15mm.
Una vez colocado el disco no debe ser removido, pues inmediatamente difunde el
antimicrobiano sobre el agar.
Incubar a 37ºC durante 18-19 horas.
Medir los diámetros de inhibición.

En base a los resultados de un urocultivo y su respectivo antibiograma se deberá elegir

el tratamiento antibiótico.

Imagen 5: Ejemplo de un antibiograma para Klebsiella

pneumoniae. Antibióticos utilizaos en el sentido de las agujas del
reloj: MEM, meropenem; TZP, piperacilina/tazobactam; cajero
automático, aztreonam; FOX, cefoxitina; FEP, cefepima; AMC,
amoxicilina/ácido clavulánico.

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9. Bibliografía:

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