INTRODUCCIÓN

Los microorganismos son seres vivos que solo pueden visualizarse con el microscopio; se
encuentran en todos lados: en el suelo, agua, superficies corporales, alimentos e incluso
en el aire. La mayoría son unicelulares sin embargo también existen microorganismos
multicelulares como algunas algas u hongos, cabe mencionar que también los virus
forman parte de los microorganismos en el campo de estudio de la microbiología aunque
no son considerados seres vivos [1].

Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con
material y medios de cultivo estériles. En Microbiología la esterilización se define como “el
proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de
resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de
microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos
métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias
termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y
cajas de plástico) [1].
La supervivencia y crecimiento continuo de microorganismos depende de un suministro
adecuado de nutrientes y un ambiente favorable para su crecimiento. Un medio de cultivo
es una solución que contiene los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de
microorganismos, en condiciones favorables de pH y temperatura. Existen 3 tipos de
medios de cultivo según sus cualidades físicas: líquidos, semisólidos y sólidos. Un medio
liquido carece de un agente solidificante y se denomina caldo de cultivo; si a un caldo se
le adiciona un agente solidificante como agar, se forma un medio semisólido o sólido [2].

Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio
normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias
como vitaminas, suero o sangre para crecer [3].

Existen varios métodos de siembra de microorganismos, para nuestra practica utilizamos

el método de siembra por estría en placa y el método de extensión en placa. El método
por estría es el más fácil y el más utilizado para obtener cultivos axénicos, para ello con
un asa se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías
sobre la superficie de un medio sólido, conforme se van haciendo estrías en zigzag con el
asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos los
cuales quedan separados e inmovilizados; después se flamea el asa, se toca en la región
donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica
[3].

Existen medios cuya composición permite el crecimiento de [3]:

1. Un gran número de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud),

2. Determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los

denominados medios selectivos.

3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas

o test bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).

Precauciones general [3]

Al calentar los medios de cultivo con agar-agar es muy importante procurar agitar
repetidamente el medio para evitar que el agar
-agar se pegue en el fondo del matraz y que se queme. Asimismo evitar que hierva para
evitar su derrame.
Etiqueta debidamente tu material de vidrio (tubos d ensayo, matraces) antes de verter los
medios de cultivo en ellos. Procura no utilizar maskin-tape.
Los cestos o las latas metálicas deben estar debidamente forrados con papel kraft o de
estraza.
El material donde se preparó el medio de cultivo sólido (agar
-agar) debe ser lavado con agua y jabón inmediatamente después de su uso. Así evitarás
que el agar
-agar se pegue al vidrio.
Antes de mandar a incubar el material con los medios de cultivo, verifica la manera cómo
hay que prepararlo para que sean recibidos (Reglamento del Área de Esterilización e
Incubación)
Disposición de desechos
 Colocar el medio de cultivo sólido sobrante sobre un papel y envolverlo, colocar el
paquete en una bolsa de plástico y desecharlo en el contenedor rojo.
Observación microbiológica.

Existen 2 métodos de diagnóstico microbiológico: los directos y el indirecto.

Los métodos directos tienen como objetivo primordial identificar al microorganismo

específico que está causando el daño o la patología, mientras que los métodos indirectos
buscan la manifestación de una patología basado en la respuesta del sistema inmune,
con la búsqueda de antígenos o anticuerpos [4].

Según su clasificación podemos encontrar:

 Métodos Directos:

- Observación microscópica.
- Identificación.

 Preparación en fresco o in vivo.

Las preparaciones al fresco son muy fáciles de preparar; se prepara una disolución
acuosa donde se introduce el microorganismo, se pone una gota en un porta, se tapa
con un cubre y se observa. Se emplean para observar la morfología de bacterias,
especialmente de espiroquetas. Sirve también para observar la movilidad de las
bacterias y para observar cambios citológicos.
 Preparaciones fijadas y teñidas

Las preparaciones fijadas y teñidas son las más utilizadas en Microbiología por dos
razones:
-La tinción facilita la visualización de la bacteria
-Con varios colorantes clasificamos la bacteria en distintos grupos.
La mayor desventaja es que la bacteria ya está muerta.

Tinción Simple: con azul de metileno. Todas las bacterias aparecen teñidas de azul.

Tinción de Ziehl-Neelsen: Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos
parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción
con colorantes básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR.
El mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como
Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La
coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante
atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Tinción de Gram: Debe su nombre al Bacteriologo Danés Christian Gram que la

desarrollo en 1844. Es una tinción diferencial, clasificando a las bacterias en Gram + y
Gram -, de acuerdo a las propiedades de su pared celular:

Tinción de Wirtz-Conklin: Principalmente se utiliza para bacterias Clostridium y Bacillus.

Identificación:
Para la identificación del microorganismo tenemos muchos métodos tanto microbiológicos
como inmunoquímicos.

1. Examen microscópico: observación directamente del microscopio lo que nos permite

analizar la morfología, la tinción, el número de bacterias presentes y la movilidad en casos
de preparaciones en fresco.

2. Cultivo de la muestra: debe utilizarse un medio de cultivo adecuado al patógeno

sospechoso. Una vez desarrolladas las colonias, se hará un aislamiento de ellas por
difusión o dilución. Se analiza el aspecto de la colonia: tamaño, forma, pigmento, bordes,
consistencia, etc.

Pruebas bioquímicas para identificar la bacteria: una vez aislada la bacteria se

sembrará en los correspondientes medios de cultivo selectivos e indicadores, de acuerdo
a la sospecha que tenga sobre el tipo de patógeno que se trata
A través de los cultivos en estos medios indicadores, se verá la acción fisiológica de la
bacteria, lo que guiará a hacer un diagnóstico de ella.

Pruebas de sensibilidad ante los antimicrobianos (antibiogramas)se realizan por lo

general antibiogramas por difusión para determinar la susceptibilidad del patógeno frente
a una serie de antimicrobianos, lo que es una guía para realizar la terapia. Son
complementarias a la identificación de microorganismos, porque un agente antimicrobiano
puede servir para varias bacterias (no diferencia totalmente a la bacteria) [4].
 Objetivos.

Objetivos Generales.

Realizar el método de toma de muestra por hisopaje y siembra en superficie.

Objetivos Específicos.

 Fundamentar los procesos adecuados para la esterilización de materiales.

 Comparar los medios de cultivos empleados para el desarrollo de los microorganismos.
 Identificar los microorganismos observados en la muestra realizada mediante tinción de
Gram y observación morfológica de hongos.

Materiales y Métodos.

Cuadro # 01. Materiales para la práctica.

Materiales Volumen Cantidad

Caja Petri 3 pulg 2

Tubo de ensayos 10 ml 3

Hisotopos 2

Matraz 250ml 3

Espátula 1

Papel aluminio 1

Pipeta 90 ml 1

Micropipeta 10 uL 1

Varilla de vidrio 1
 Gradilla 1

Puntas de Micropipeta 5.0 – 300 uL 2

Bala 1

Asas de platino 1

Cuadro # 02. Equipos para la práctica.

Equipos Cantidad
Balanza analítica 1

Autoclave 1

Cámara de flujo laminal 1

Baño María 1

Encubadora 1

Mechero 1

Termo agitador magnético

Cuadro # 03. Insumos para la práctica.

Insumos Cantidad
Azul de metileno 1

Violeta cristal 1

Lugol 1

Agua destilada 1
 Agar 1

Pectona 1

Dextrosa 1

Métodos.

Esterilización de materiales.

Los materiales fueron esterilizados de la siguiente manera:

 Las cajas petri se cubrieron con papel aluminio

 Los hisotopos fueron colocados en tubos de ensayos y fueron tapados con papel
aluminio.
 Las puntas de la Micropipeta fueron colocadas en un vaso de precipitación y se cubrió
con papel aluminio.
 Las pipetas se cubrieron sus puntas con papel aluminio.
 Se elaboraron tiras de papel aluminio que se utilizarían en la toma de muestra.
 Luego que todos los materiales fueron cubiertos correctamente se los coloco en el
equipo autoclave a una temperatura de 125 ºC por un tiempo de 30 minutos.
 Después de su esterilización los equipos fueron colocados en el equipo de cámara de
flujo laminar para su debido uso.

Preparación de medios de cultivo.

Para la preparación de los medios de cultivos los cuales serían los nutrientes para el
desarrollo de la población microbiana se usó agua de peptona, papa dextrosa y agar
nutritivo se los preparo de la siguiente manera.

 Se leyó las indicaciones de los envases de los diferentes medios de cultivos.

 Se determinó la cantidad necesaria del cultivo con la cantidad de agua destilada
requerida y luego fue pesado con el uso de la balanza analítica.
 El agua de pectona fue colocada en un matraz y solo se agito por ser un medio liquido
no requirió calentamiento.
 El agar nutritivo y la papa dextrosa se los colocó en un matraz diferente y paso a un
proceso de calentamiento con el uso del termo agitador.
 Luego que se preparó los medios de cultivo fueron esterilizados en el autoclave
después de este proceso los medios solidos fueron colocados en el equipo baño maría.
 El agua de pectona luego de ser esterilizada fue colocada en la cámara de flujo
laminar.

Papa dextrosa: 250ml 9,75 gr

Agar nutritivo: 300ml 9.3 ml

Toma de muestra.

La toma de muestra fue empleada el método de isopaje y se realizó de la siguiente

manera.

 Se tomó dos tubo de ensayo el cual uno tenía los hisotopos y el otro el agua de
pectona.
 La muestra fue tomada de la facultad de ciencias agropecuarias.*
 Con el uso de las tiras de papel aluminio se formó un marco dejando la parte de en
medio vacío.
 Se retiró los hisotopos del tubo de ensayo se tomó la muestra en forma ascendente y
descendente se marcó todo el marco de lado a lado.
 Tomada la muestra los hisotopos se los coloco en los tubos de que contenían el agua
de pectona.
 Y se los llevó al laboratorio para seguir con el análisis.

*(Véase en anexos)

Siembra.
Para la siembra del medio de cultivo fue necesario el uso de guantes y la limpieza del
mismo con alcohol y fue realizado de la siguiente manera.

 Se tomó dos cajas petri y se vertió en cada de ellos los medio solidos que todavía
estaban líquidos.
 La cantidad necesaria es variable pero es recomendable el uso de 10 a 15 ml para
cada caja y se esperó que se gelatinicen.
 Ya pasado este paso se tomó una cantidad de la muestra tomada anteriormente con el
uso de la Micropipeta y se la coloco en cada medio gelatinizado.
 Se lo cubrió por toda la caja petri y se rotulo cada caja petri.
 Luego cada muestra se lo coloco en la encubadora los medio aerobio mesofilo se los
coloco a una temperatura de 37°c y los hongos a una temperatura de 25°c se los dejo
por un tiempo de 24 h.

Observación microscópica.

Pasada las 24h se tomó los medios cultivados y se realizó los siguientes procesos
para su observación.

Tinción de gram (aerobio mesofilo).

Para la observación de las bacterias fue necesario el uso de porta objetos y cubre objetos,
se realizó la tinción de gram que nos facilita la observación bacteriana pues la divide en
Gram+ y Gram- para la preparación de esta se siguió el siguiente proceso.

 Se colocó la caja petri cerca del mechero y con el asa de platino esterilizado se tomó
una muestra y se la coloco en el porta objetos.

 Cubrir el frotis con dos gotas de cristal de violeta durante 30 segundos a 1 minuto.
 Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso
de colorante.
 Sacudir un poco y cubrir con 2 gotas de lugol por 30 segundos.
 Lavar el frotis con agua destilada.
 Aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra y no fluya más tintura y lavar.
 Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.
 Lavar nuevamente con agua destilada y secar con papel el exceso de agua.
 Luego que este seco colocar el cubre objetos y llevarlo al microscopio para su análisis
correspondiente.

Toma de muestra de hongos.

Para la observación de hongos se requiere el siguiente proceso.

 Se tomó la muestra donde contenía el hongo y con el asa de platino se tomó una
muestra con una cantidad considerada.
 Luego ya obtenido el frotis se tomó una gota de safranina y se le coloco en el
cubre objetos.
 Con agua destilada se eliminó el exceso de muestra.
 Se secó los bordes y se colocó el cubre objetos y se los llevo para su observación
microscópica.

Resultados.

Aéreo mesofilo.

Resultado: Positivo.

Tipo de Lente 40 Lente 10 Observación

muestra
Bacteria En la
observación se
presenta la
presencia de
bacterias
distribuidas en
la muestras.

En la práctica realizada se obtuvo como resultado la presencia de bacterias en Gram+

permitiendo diferenciar la morfología gracias a la tinción lo cual permite visualizar las
diferentes tipos de colonias.
Hongos

Resultado: Positivo

Tipo de Lente 40 Lente 10 Observación

muestra

Bacteria En la
observación
de hongos con
la utilización
de
microscopio
nos permitió
presenciar la
presencia de
hongos
presente en la
muestra.

En la muestra tomada con la utilización de insumos el cual permitió la observación de la

presencia de hongos con su estructura completa sus ramificaciones logrando resultado
positivo en la práctica.

Conclusiónes

Para un correcto análisis microbiológico en necesario el uso de materiales que deben

estar estilizados que permita una toma de muestra eficiente.
Es necesario tomar medidas correctas del medio de cultivo que permita el desarrollo del
microorganismo obtenido.

Describir correctamente la toma mostrada y determinar los resultados obtenidos.

Recomendaciones.

En el análisis microbiano es necesario seguir pasos precisos y concisos que permitan un

análisis correcto y sin problemas, un buen uso de los materiales permitirá y métodos de
toma de muestra permitirán una buena práctica de laboratorio.

Anexos.

Colocación de materiales en el equipo

autoclave
 Calentamiento del medio solido en el Rotulado de los medio de cultivo
equipo termo agitador.

Esterilización de materiales

Fuente:
PesadoCajape J; Delgado
del medio Disolución
de cultivo L; Cabo A; Bailón J; AcostadelM;medio
2107. de cultivo en agua
destilada
 Toma de muestra microbiana

Colocación del medio solido en cajas Toma de muestra microbiana

petri

Toma de la muestra a sembrar en los

diferentes medios de cultivo.

Toma de la muestra a sembrar en los Encubación de la siembra

diferentes medios de cultivo. microbiológica.

Observación morfológica de hongos. Observación morfológica de bacterias.

Fuente: Cajape J; Delgado L; Cabo A; Bailón J; Acosta M; 2107.

Preparación teñida o tinción de la Tinción la muestra.
colonia microbiológica.

Agregación de lugol.

Agregación de gota de lugol.

Esterilización del asa de platino.

Observación microscópica con lente 40 Observación microscópica con lente 10

bacterias. bacterias.

Observación microscópica con lente 10

Observación microscópica con lente 40
hongos.
de hongos.
 FICHA DE DATOS DE SEGURIDAD

Datos de identificación personales:

Nombres:
Dirección
Edad:
Email:
Residencia:
Datos de identificación de la muestra:

Fecha:
Hora:
Dirección:
Objeto de muestreo:
Forma de transporte:
Punto de origen:
Lugar de destino:
Método de muestreo utilizado:
Temperatura del objeto del muestreo:
Temperatura de almacenamiento:

Razón:
Bibliografía.

 [1] Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack

Parker – Editorial Pearson.
 [2] Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos
Generales (2 da Edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central Venezuela.
 [3] Barry, A. y S. Gibson. 2002. Control de calidad en microbiología, en Dharan, M.
Control de Calidad en los Laboratorios Clínicos. Ed. Reverté. Sevilla, España.
 [4] Toma de muestra y diagnóstico microbiológico blogger