Métodos y Técnicas de Tinción

La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su

entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción
con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste.
En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de
microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación,
procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con
diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la
más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el
portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un
mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos
pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol,
formaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las
estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva
es la más frecuente, en ella un colorante se une aciertas estructuras microbianas. Todos
los colorantes utilizados en microbiología tienen en común la presencia de grupos
cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los responsables del color
mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos,
los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se
unen por enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de
DNA, donde el colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte, en la tinción negativa
se utilizan compuestos que no penetran en las células sino que impregnan el medio
circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.
OBSERVACIÓN “IN VIVO”
Método de la gota pendiente.
Este procedimiento es la forma más sencilla de observación de organismos vivos, nos
proporciona información sobre la morfología, tamaño, color y movilidad de las
bacterias. Sin embargo, debido a la falta de contraste con el entorno es una práctica que
se utiliza únicamente para la observación del movimiento.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Escherichia coli y Pseudomonas sp.en medios de cultivo líquido
(caldo triptona soja), vaso lavador, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa de
siembra, pipeta Pasteur, aceite de inmersión.
Procedimiento
Tomar una gota de un cultivo líquido reciente (24 horas) usando unasa de siembra o
una pipeta Pasteur estéril.
Colocar en el centro de un cubreobjetos y añadir cuatro pequeñas gotas de aceite en los
cuatro extremos.
Colocar el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando que la gota quede
situada en el centro de la depresión.
Dar la vuelta al portaobjetos.
Colocar una gota de aceite de inmersión y observar con objetivo de inmersión (100x).
Esta técnica permite observar el desplazamiento rápido y rectilíneo o dando giros y
volteretas en aquellas bacterias que tienen flagelos (Video complementario). Las
bacterias inmóviles presentan un movimiento vibratorio denominado movimiento
browniano, debido al choque de las moléculas enuna solución líquida.
Método de observación directa en contraste de fases o interferencia diferencial. En este
caso la suspensión de microorganismos se observa con un microscopio de contraste de
fases o interferencia diferencial (DIC) que permiten el aumento del contraste. El
microscopio de contraste de fases utiliza un condensador con un diafragma anular opaco
con un anillo transparente que provocan variación de la longitud de onda dependientes
de la densidad y el índice de refracción de la muestra, se observan las células más
brillantes sobre un fondo oscuro. El microscopio de interferencia diferencial permite la
observación tridimensional de la muestra por la incorporación de prismas que generan
haces de luz polarizada que se cruzan, incrementando las diferencias entre los
componentes celulares por lo que es muy útil para la observación de esporas,
inclusiones, filamentos septados o vainas entre otros.
Material necesario
Cultivos bacterianos en medio líquido, portaobjetos y cubreobjetos, pipetas Pasteur,
aceite de inmersión.
Procedimiento
Se deposita una gota de la muestras obre un cubreobjetosy se coloca encima un
portaobjetos excavado. La preparación se observa directamente al microscopio
decontraste de fases o de DIC.Reduca (Biología). Serie Microbiología.3 (5): 15-38,
2010ISSN: 1989-362018. Observación de Zooglea ramigeray bacterias filamentosas.
Microscopía de Interferencia diferencial (100x).Observación de Anabaenasp.,
cianobacteria filamentosa. Microscopía de contraste de fases (100x).
TINCIONES
Tinción negativa
No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con
cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los
colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de nigrosina o
tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que formarán una película
opaca a la luz. En este tipo de tinción se prescinde de la fijación por calor, se deja secar
la preparación y se observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Tinción simple
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes
derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del
alquitrán.
Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula
está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son
colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en
bacteriología son safranina, fuchina básica y verde malaquita.
Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un
pH interno próxima la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada
negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces.
Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un
cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir positivamente ciertos
componentes como las proteínas.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Staphylococcusaureus y Micrococcus luteus, frasco lavador,
cristalizador, soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de siembra, aceite de
inmersión.
Procedimiento
Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota
de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el
asa de siembra. Dejar secar.
Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Añadir una gota de aceite de inmersión.
Observar con objetivo de inmersión (100 x).
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma,
tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de
ser un método muy sencillo y rápido.

TINCIÓN DIFERENCIAL
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la
aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso
intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre
determinadas células dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada
por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes
a la tinción en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en
bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido alcohol resistencia.
Tinción de Gram Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian
Gram(1884)(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos
fallecidos por neumonía observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en
los pulmones, retenía el colorante conocido como marrón Bismark(sustituido
posteriormente por el cristal violeta),mientras que el tejido pulmonar no era capaz de
retener el colorante.
Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera
prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio.
Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación
celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las bacterias. La
tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes
grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram
negativa.
Material necesario
Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereusy.
Gram negativas: Escherichia coli, frasco lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos,
asa de siembra, cristal violeta, safranina, lugol y alcohol, aceite de inmersión.
Procedimiento
Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un cultivo
bacteriano con el asa de siembra estéril.
Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de
siembra. Dejar secar.
Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Añadir el mordiente lugol, solución de yodo -ioduro potásico, durante 1 minuto.
Lavar el exceso de mordiente con agua.
Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la preparación, durante 30
segundos (el tiempo de decoloración es clave para un resultado correcto).
Lavar inmediatamente con abundante agua.
Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Añadir una gota de aceite de inmersión.
Observar con objetivo de inmersión (100 x).
La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de
organismos hace que ambos grupos respondan de manera distinta, así mientras las
bacterias Gram positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las
bacterias Gram negativas se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol,
admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que
contrasta con el intenso color violeta.
Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los
microorganismos a esta tinción, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura
física como a la composición de la pared celular, en bacterias Gram positivas la gruesa
capa de péptidoglucano con abundantes entrecruzamientos parece contribuirá la
retención del colorante fundamental, cristal violeta, mientras que en bacterias Gram
negativas la delgada capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lípidos en la
membrana externa de la pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a
la pérdida del colorante fundamental después de la decoloración con alcohol.
Tinción de ácido-alcohol resistencia
Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-
Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir
aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos
suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-
alcohol resistentes).
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes
patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos
responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.
Tinción Gram:
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico. Su utilidad en la práctica de referencias a la morfología celular
bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción
de GRAM
1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta.
2. Se añade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol. En
este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram
positivas retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram
negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les
proporciona un color violeta más intenso.
Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos:
1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el
interior de la célula.
3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante
elimina la fucsina de todas las células excepto de las micro bacterias, que la retienen
debido a su superficie cérea.
4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células
previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de
Mycobacterum, aún teñidas de rojo, v las células restantes del espécimen.
Tinción: RODAMINA-AURAMINA
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para
los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que
aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El
permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica.
Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios
parásitos, se tiñen con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis
pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre
la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma,
los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que
además permiten la diferenciación morfológica.
Tinción: NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de
acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el
microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se
intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la
tinción.
Colorantes:
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos.
Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer
más visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para
ser utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.
Azul Nilo: Tiñe los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir
células vivas.
Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe
las paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en
la coloración de Gram.
Eosina: La eosina se utiliza más frecuentemente como contra coloración de la
hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al
material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares.
Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada
también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros protocolos de
tinción.
Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo,
y se utiliza principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para
darle una coloración amarilla al colágeno.
Verde de metilo; El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo
claro, para teñir la cromatina de las células y facilitar así su visualización.
Por Reyes Diego
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con
el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y
alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células
que han sido fijadas sobre un portaobjetos. Tratando después éste con el agente fijador,
y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción.
Conceptos básicos.
Tinción primaria: es el colorante principal que se va usar para teñir en un principio a las
células.

Mordiente: es la sustancia que sirve para fijar los colorantes en la tinción.

Agente decolorante: es como su nombre lo indica, el agente que ayuda a decolorar una
parte de las células que se han teñido.

Tinción de contraste: es la sustancia que contra tiñe las células que han sido
previamente decoloradas y además le da un color diferente de la primera vez que se
tiño.
Tinciones para microbiología.
Tinción de Gram.

Tinción de Ziehl-Neelsen

Tinción de Schaeffer-Fulton

Tinción de Conklin

Tinción de Grocott

Tinción de Dieterle

Tinción negativa

Tinción con mucicarmina

Tinción simple.
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la
misma tonalidad.
El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya
que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula
huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas
(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china
y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de
metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para
observar la presencia de leucocitos.
Tinción de Gram
También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células,
un proceso denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente
utilizada es la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans
Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram,
las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.
Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con
cierto detalle la tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se
tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan
efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante.
En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están
teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) –
yoduro potásico (KI). El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico
simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a
cabo después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las
que es soluble el complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos)
no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial
entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la decoloración.
Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las
gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se
utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como
la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células
gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.

Tinción ácido – alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que
tienen un alto contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser
calificadas por la tinción de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una
mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de
mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles como las
resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido –
alcohol sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan
rosa. Como en la tinción de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es
el azul de metileno que tiñe las células ácido – alcohol sensibles de color azul quedando
las células ácido – alcohol resistentes de color rosa.
Tinción de esporas
Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.
Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de
verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las
endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de
color rosa mientras que las endosporas continúan con su color verde de la verde
malaquita.

Tinción negativa
Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se
colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las
células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene
afinidad con los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como
la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina
(un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está
en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.