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INFORME LABORATORIO MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

Grupo 2
Microbiología ambiental

Presentado por:
Carlos Andrés Ordoñez código 1.117.541.665
Nohora Viviana rivera código: 1.073.232.125
Rigoberto García g. código 79445548
Yeimi yulieth Cárdenas código: 1.077.091.618
Laura juliana Bernal olmos 1.048.850.702
Yudi aurora Vásquez Chacón 1.072.365.846

Presentado a:
Daniel Marín

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA


ENFASIS EN MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
BOGOTÁ DISTRITO CAPITAL
2018
INTRODUCCIÓN

La microbiología como ciencia se encarga del estudio en general de


microorganismos que no son visibles al ojo humano, necesariamente se tiene que
utilizar el microscopio como instrumento principal para desarrollar dicha función.
En el momento de tener la oportunidad de identificar y realizar un proceso
microbiológico, como lo pudimos desarrollar en nuestra práctica de laboratorio,
abarcando diferentes temas desde identificación de diferentes tipos de hongos,
levaduras, cultivos entre otros factores que se relacionan en dicho informe. Así
mismo las experiencias que cada uno de nosotros pudimos lograr, es la ganancia
que cada uno podemos recibir como personas idóneas y preparadas en áreas
enfocadas al estudio del medio ambiente o recursos naturales.
RESUMEN

El estudio de microorganismos mediante el microscopio óptico es muy utilizado


para llevar a cabo observaciones que a simple vista no se pueden ver, el
microscopio nos permite observar los microorganismos (los presentes en esas
mismas muestras), tales como hongos o bacterias. El procedimiento que se utiliza
suele iniciarse con la toma de muestras de los tejidos a analizar. El cultivo sirve
para lograr una proliferación de estos microorganismos y de ese modo poder
estudiarlos mejor.

Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en el medio de


cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma, tamaño etc. propias
de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. También se puede someter a
las bacterias de las colonias a pruebas bioquímicas o de otro tipo para lograr su
identificación.

Las técnicas de tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se


absorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las
células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio
óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente
sin algún tratamiento previo.

1. Tinción diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre


células bacterianas o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan
más de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción.
2. Tinciones simples: Un colorante; proporciona contraste para observar mejor
un organismo completo. Se tiñe con un colorante básico (azul de metileno,
cristal violeta, o fucsina básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente
con agua. Se tiñen casi todas las bacterias; la mayoría de los tejidos no se
tiñen.
3. Tinción de Gram: Dos o más colorantes; distingue entre bacterias Gram
positivas y Gram negativas. Se cubre la preparación de bacterias fijadas con
cristal violeta y después con una solución de iodo. Todas las células quedan
teñidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%. Las células
Gram positivas permanecen detenidas, pero las negativas pierden el colorante.
Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se
vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.
4. Tinción de ácido-alcohol resistencia: Se trata de un procedimiento de tinción
diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia
por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos
cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol
resistente) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol
resistente).

Palabras clave
Microorganismos, bacterias, hongos, muestra, microscopio.

METODOLOGÍA
Instrumentos

● Asa redonda
● Cajas de Petri
● Mechero
● Incubadora
● Vasos de precipitado 50 ml -100 ml
● Agitador de vidrio o espátula
● Gotero estéril
● Mechero de gas
● Marcador de vidrio
● Portaobjetos
● Cubreobjetos
● Asa redonda o curva
● Asa recta
● Pipetas estériles de 1 y 2 ml
● Estufa
● Contador de colonias
● Microscopio
● Recipiente plástico o de vidrio
● Un vaso precipitado de 100 mL con 90 mL de agua destilada
● estéril.
● Un recipiente de plástico o vidrio con 20 mL de etanol al 70 %.
● Un recipiente de plástico o vidrio con 20 mL de hipoclorito de sodio (o
clorox) al 3 %.
● Cuatro tubos de ensayo con 9 mL de agua destilada estéril.
● Cinco pipetas de vidrio de 1 mL estériles.
● Azul de metileno (reactivo).
● Metanol o etanol (reactivo).
● Incubadora ajustada a 25 °C.
● Incubadora ajustada a 37 °C.
● Balanza gramera o analítica.
● Medio gramo de peptona pancréatica de caseína (reactivo).
● Ocho cajas de Petri con agar nutritivo (AN).
● Un rastrillo de plástico estéril.
● Unas pinzas metálicas estériles.
● Láminas para cortar o bisturí.
● Una caja de Petri estéril vacía.
● Dos cajas de Petri con Agar Sabouraud y dextrosa (ASD).
● Página 5 de 20

Reactivos

● Muestra contaminada con microorganismos


● Agua peptonada a pancreática de caseína
● Agar nutritivo
● Agua destilada estéril
● Cristal violeta
● Lugol
● Alcohol cetona
● Fucsina básica o safranina
● Azul de lactofenol
● Cultivo de Hongos
● Agar Baird Parker
● Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri
● Caldo nutritivo
● Agua con cianobacterias

La elaboración de este trabajo se realizó en un entorno de aprendizaje en


laboratorio de microbiología estudiando los diferentes organismos dentro del
mismo por medio de etapas:

1. Crecimiento de Mohos en el pan

1. Disuelva los 2.5 g de azúcar de mesa en 20 mL de agua destilada


2. Adicione 20 gotas de esta disolución en diferentes partes del pan tajado.
3. Introduzca la muestra que acaba de tratar en la bolsa transparente, y ciérrela.
4. Incube a temperatura ambiente en un lugar oscuro
2. Observación de levaduras

1. Disuelva 2.5 g de azúcar de mesa y aproximadamente 5 g de levadura de pan


en 20 mL de agua destilada
2. Incube la disolución anterior a 37 °C por 15 min.
3. Tome una muestra de esta disolución y disponga sobre un portaobjetos. Puede
asistirse de un asa bacteriológica de punta redonda estéril o un agitador de vidrio
estéril.
4. Adicione una gota de azul de metileno, deje actuar por 3 min y disponga un
cubreobjetos sobre esta muestra
5. Observe en el microscopio utilizando los 4 objetivos: 4x, 10x, 40x y 100x. Dibuje
y señale estructuras celulares (gemas, pared y núcleo).

3. Observación de bacterias probióticas

1. Tome una gota de yogurt y mézclela con una gota de agua destilada estéril
sobre un portaobjetos. Puede asistirse de un asa redonda.
2. Extienda la muestra y séquela completamente. Puede asistirse del calor del
mechero, evitando sobrecalentar la muestra.
3. Cubra la muestra con metanol o etanol durante 10 s para limpiar la parte
grasa.
4. Escurra el alcohol adicionado y deje secar a temperatura ambiente. No vaya a
utilizar el mechero.
5. Cuando la muestra esté completamente seca, cúbrala con azul de metileno y
deje actuar por 2 min.
6. Elimine el exceso de azul de metileno y deje secar nuevamente.
7. Observe en el microscopio utilizando los 4 objetivos: 4x, 10x, 40x y 100x.
Dibuje y señale los diferentes grupos bacterianos (cocos y bacilos)
ANÁLISIS Y RESULTADOS

Crecimiento de mohos en el pan:

4X 10X 40X 100X

Análisis:

En esta práctica se evidenció que después de una semana, en el pan empezó a


crecer moho, alrededor de un 10 % del pan tenía moho, por la cual se puede
inferir que la temperatura a la que estaba el pan durante la semana, estaba entre
18 y 25 grados Celsius, esto se puede reducir debido a que a temperaturas frías el
moho no puede crecer adecuadamente. A medida que los mohos crecen, se
forman esporas, pequeñas partículas visibles que le confieren el color verdoso,
blanco o grisáceo al alimento. Esto es sinónimo de que los mohos han penetrado
muy en el interior del alimento.
Los resultados del avistamiento en el microscopio arrojan estructuras muy
parecidas al hongo Penicillium contando también con las condiciones de su
crecimiento.

Conclusión:

Durante el crecimiento del moho del pan se observó que fue necesario una
semana para obtener un hongo que en este caso se dio en una sola tajada de pan
y su crecimiento fue efectivo, el hongo se identificó como un Penicillium ya que las
estructuras observadas fueron muy parecidas a las de este hongo al igual que
coincide con el tiempo y temperatura en el que este se desarrollaba.

Observación de levaduras:

4X 10X 40X 100X

Imagen: estructura de levaduras


Tomada de: http://galeon.hispavista.com/alezamora/img/CELYEAST.gif
Análisis:

Las levaduras son los agentes de la fermentación y se encuentran naturalmente


en la superficie de las plantas, el suelo es su principal hábitat encontrándose en
invierno en la capa superficial de la tierra.
Durante el proceso se evidenció el crecimiento de las levaduras en un entorno
a 37°C de las que se tomó muestra y se observó una muestra compacta donde no
fue posible identificar las estructuras dentro del mismo.
La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares sencillos microscópicos, la
mayoría se reproducen sexualmente por germacion, y otras especies lo hacen por
fisión múltiple. Además los criterios morfológicos se basan en el modo de
reproducción vegetativa de la morfología celular de la formación de pseudomicelio
y de micelio. La forma de la levadura puede ser desde esférica u ovoide, en forma
de limón, piriforme, cilíndrica, triangular e incluso alargada formando un verdadero
micelio o un falso micelio.

Conclusión:

Concluimos que el proceso de visualización de las levaduras en el laboratorio, fue


exitoso ya que pudimos observar con claridad, la estructura, forma y colores de
este tipo de hongos, cuya función práctica en nuestra vida diaria es la de generar
un tipo de fermentación para bebidas y panes, de igual forma logramos conocer
este tipo de microorganismos como ser funcional en diferentes proceso tanto
industriales como naturales.
Observación de bacterias probióticas:

4X 10X 40X 100X

Análisis:

El yogurt es un producto lácteo que se obtiene por fermentación natural de la


leche, en este proceso intervienen dos tipos de bacterias las cuales son
Streptococcus Thermophilus y Lactobacillus bulgaricus.

Mediante la observación con el microscopio óptico se pone en manifiesto la


presencia de estos microorganismos, en las imágenes que se muestran
anteriormente se pudo apreciar la morfología de las bacterias presentes y las
extensiones de las mismas. se observaron cadenas, de las cuales se trataba de
cocos unidos entre sí a lo largo (100x) y las segundas se observaron solas o
próximas, las cuales se trataban de bacilos (40x).
Los estreptococos son un género de bacterias gran-positivas y catalasa negativos,
esféricas pertenecientes al filo firmicutes. Streptococcus Thermophilus, es una
bacteria homofermentativa termorresistente produce ácido láctico como principal
producto de fermentación.
Los lactobacilos son bacilos microaerófilos, Gram positivos y catalasa negativos,
estos organismos forman ácido láctico como producto principal de la fermentación
de los azúcares.

Conclusión:

Streptococus thermophilus es una bacteria gram positiva anaerobia facultativa.


Esto quiere decir que puede desarrollarse tanto en presencia como en ausencia
de oxígeno, por lo que pueden llevar a cabo tanta respiración convencional como
procesos fermentativos,en los que entra en juego la elaboración del
yogurt.logramos identificarla dentro del proceso realizado en el laboratorio gracias
a sus estructuras presentadas en el microscopio de forma redondeada y no
ovalada como son las demás bacterias probióticas que existen.
ESTACIÓN 1: BACTERIAS EN EL SUELO

Procedimiento:
Reporte de conteo de “bacterias en el suelo”. Análisis del reporte en relación con
las diluciones y a la naturaleza de la muestra tratada.

Cálculos y registros fotográficos


Análisis:

Como ya sabemos el suelo es el componente donde más abundan las bacterias


(microbiota), y así mismo se pudo demostrar con el estudio de bacterias del suelo
en cada una de las tres diluciones realizadas, existen miles de bacterias por cada
gramo de suelo y en cada disolución se forma una gran cantidad de colonias que
se multiplican por fisión binaria, en nuestro caso en un lapso de tiempo de 8 días
en condiciones controladas en el laboratorio de microbiología. Muchas bacterias
crecieron en pares (diplococos), cadenas (estreptococos) o racimos
(estafilococos), así como células individuales en la disolución y se vieron
reflejadas en el estudio realizado, todo este proceso nos lleva a concluir, cuál es el
proceso de reproducción de bacterias de tierra, en un ambiente controlado como
lo es un laboratorio.
Así mismo podemos analizar qué cantidad de bacterias puede tener una muestra
de tierra donde podemos determinar todo el ciclo de vida de dichos
microorganismos, con el objetivo primordial de estudiarlas, conocer sus
comportamientos y posiblemente su utilidad.

Además, el resultado obtenido nos muestra algo ilógico porque en la dilución


menor hay menos cantidad de unidades formadoras de colonias, debería ser al
contrario, esto podría tratarse de un error al preparar la dilución.

ESTACIÓN 2: RECUPERACIÓN DE HONGOS ACUÁTICOS VERDADEROS


Materiales, Reactivos y Equipos

Materiales Reactivos Equipos

Semillas de girasol Azul de lactofenol Caja Petri

Agua sin tratar de una Agua destilada Mechero


PTAR Hospitalaria
Etanol Microscopio

Cálculos y registros fotográficos


Análisis:

Los hongos presentan la característica de ser descomponedores de materia


orgánica presente en los diferentes cuerpos de agua, ya que estos tiene la
capacidad de colonizar, degradar y modificar la materia orgánica presente en el
agua, motivo por el cual muchos de estos participan en la purificación del agua y
otros por el contrario son parásitos que atacan a diversos organismos como algas
y animales acuáticos.

Los hongos acuáticos poseen características que los distinguen de los demás
hongos, ya que en éstos el micelio, cuando existe, es típicamente cenocítico, las
esporas asexuales se producen comúnmente dentro de los esporangios, y al
efectuarse la reproducción sexual se forman estructuras de resistencia que
pueden ser oosporas o esporangios de latencia, dependiendo del phyllum al que
pertenezcan.

Los hongos acuáticos se pueden propagar por medio de una multiplicación


vegetativa que se efectúa por fragmentación de las hifas, así como por esporas
asexuales y sexuales yllum al que pertenezcan.

En el presente laboratorio las semillas sirvieron como cebo para los hongos
acuáticos, que presentan flagelos y por quimiotaxis se desplazan y colonizan la
semilla, donde se logró evidenciar transcurridos los ochos días de su incubación la
colonización de los hongos tanto por fuera de la semilla como por dentro de la
misma. en la parte externa de la semilla son fue posible visualizar de manera
macroscópica el crecimiento micelial blanco y en la parte interna de la semilla con
la utilización de azul de lactofenol el cual presenta tres características que lo
hacen especial para observar estructuras en los hongos:

● El fenol destruye la flora acompañante (algunas veces en los cultivos,


juntos a los hongos pueden crecer colonias de bacterias)
● El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al crear, por decirlo de
algún modo, una película que las protege provocado por un cambio de
gradiente osmótico entre el interior y el exterior de dicha estructura.
● El azul de algodón tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de
los hongos microscópicos

Gracias a estas propiedades del azul de lactofenol nos fue posible visualizar en el
microscopio a objeto de 40x las estructuras del hongo tales como hifas, septos,
esporas y esporangios, logrando también evidenciar que a objeto de 100x no es
posible su visualización ya que los hongos presentan un mayor tamaño que las
bacterias y su visualización ideal se obtiene a objeto de 40x

ESTACIÓN 3: RECUPERACIÓN DE HONGOS TRANSITORIOS, POR


FILTRACIÓN

Procedimiento:

Cálculos y registro fotográficos:

4X 10X 40X 100X


ESTRUCTURAS

Análisis:

De acuerdo a lo obtenido con el experimento de recuperación de hongos


transitorios por filtración, se observó que se formaron hongos de diferentes
diámetros, formas y color resultado de procedimiento realizado en el cual se
utilizó agua de un reservorio de flores y algunos agregados químicos para la
formación de los mismos, para la obtención de este resultado se dejó en cultivo
durante 8 días en una temperatura de 25°C para la formación de los diferentes
microorganismos en los cuales se evidenciaron 53 unidades, como lo podemos
observar en los diferentes objetivos del microscopio y a su vez de evidencia en el
registro fotográfico.
ESTACIÓN 4: AISLAMIENTO DE BACTERIAS HABITANTES EN LA PIEL

4X 10X 40X 100X


Resultados:

Mano sucia Mano limpia

Forma: irregular Forma: Circular Forma: circular

Cantidad:1 Cantidad:8 Cantidad:16


Color: Amarillo Color: Amarillo Color: Amarillo
Superficie: Plana Superficie: Convexa Superficie: Convexa
Borde: Ondulado Borde: Redondeado Borde: Redondeado

Análisis:

Es este caso al parecer la mano limpia tenía más bacterias que la mano sucia, sin
embargo, no todas las bacterias que tenemos en las manos son peligrosas para el
organismo, son bacterias inofensivas e incapaces de causar una infección y son
beneficiosas portarlas ya que impiden la proliferación de especies patógenas
cumpliendo la función de defender nuestro organismo; pero muchas de ellas si son
las causantes de muchas enfermedades infecciosas como las que están presentes
al tener la mano sucia, ya que estas se proliferan y empiezan a atacar
rápidamente, si la persona tiene el sistema inmune bajo tiene más posibilidades de
enfermar porque tiene las defensas muy bajas. También es importante tener en
cuenta que existen bacterias capaces de causar daño en circunstancias normales.
No son claras las estructuras ya que la capa de la muestra es muy gruesa pero se
identificaron cocos y bacilos dentro de la misma.

Cocos: son bacterias que se caracterizan por su forma esférica, tienen la


capacidad de vivir solas o enlazarse hasta formar cadenas además puede causar
infecciones en la piel, intoxicación alimenticia, amigdalitis entre otras.

Bacilos: son bacterias características por su forma de bastón, pueden ser Gram
positivas o negativas, causan distintas enfermedades; dentro de las más
destacadas en la tuberculosis.

Conclusión:
Se logra identificar tanto cantidad como tipos de bacterias habitantes de la piel,
tras un proceso de tinción, logrando reconocer sus funciones generales como
microorganismos habitantes de la piel, podría tratarse de Malassezia que es muy
abundante en el cuerpo humano,así mismo,conocimos cuál es el proceso de
laboratorio para identificar dichas bacterias.
Pero la confusión en el resultado se puede deber a un mal procedimiento o tal vez
presencia de microorganismos en el agua de lavado que permiten el afloramiento
de colonias.

ESTACIÓN 5: AISLAMIENTO DE ORGANISMOS ENDÓFITOS

Glosario:

Las soluciones hipotónicas, isotónicas e hipertónicas son formas de nombrar


unas mezclas homogéneas formadas por un soluto que pueden ser clasificadas
como cristaloides y coloides (Thomas Graham, 1861). Tienen la capacidad de
disolverse en un solvente como el agua (H2O), considerado el solvente universal.

En el grupo de los cristaloides Graham seleccionó aquellos que tienen una buena
capacidad de disociarse en el agua y formar iones, por lo pueden dializarse y
difundirse a través de las membranas semipermeables de la célula. Ejemplos de
estos son el NaCl y/o azúcar en concentraciones (osmolaridades) diferentes o en
proporciones diferentes.
Soluciones hipotónicas

Para estudiar la clase de solución hipotónica, isotónica e hipertónica, es necesario


tener una solución patrón que sirva de comparación. Para esto se compara con la
concentración de solutos dentro de la célula.

En una solución hipotónica, la concentración de todos los solutos fuera de la célula


—es decir, en el líquido extra celular (LEC)— es menor que los solutos dentro de
la célula, llamado líquido intra celular (LIC).

Soluciones isotónicas

Las soluciones isotónicas son las que tienen una concentración en solutos u
osmolaridad igual dentro y fuera de la célula. La presión osmótica es la misma, por
lo que siempre hay un equilibrio entre el LEC y el LIC, que están separados por
una membrana.

Estas soluciones son muy importantes para hidratar el compartimiento


intravascular en situaciones de pérdida de gran cantidad de líquidos y en
hemorragias, entre otros escenarios. Es necesario administrar entre 3 y 4 veces el
volumen perdido para lograr la reposición de los fluidos.

Soluciones hipertónicas

En esta clase de soluciones la osmolaridad del soluto en el LEC es mayor que en


el LIC. La presión osmótica generada hace que el agua presente en el interior de
la célula pase a la parte extracelular.

Estas soluciones son muy útiles cuando las células presentan intoxicación por
agua, cuando han estado en un medio hipotónico mucho tiempo y se encuentran
hinchadas. Por ello, una administración de solución hipertónica causa una
deshidratación celular y sería beneficiosa para la célula.

Agar nutritivo: es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo
tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativamente altas
temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas.
ASD: Agar, Sabouraud y dextrosa.

Microorganismos endófitos: se les denominan endófitos, por que viven dentro


de los diferentes tejidos, tales como las raíces, tallos, hojas, flores y frutos. Los
principales organismos endófitos pueden ser bacterias, virus y hongos.

Microorganismos epifitos: Epibacterias presentes en el exterior de la planta


(rizosfera o filoplano).

Morfotipos: Grupo de microorganismos que se pueden diferenciar.

Resultados obtenidos:

Montaje inicial Incubación con agar nutritivo Incubación con agar


sabouraud y dextrosa
Análisis de resultados:

Si se comparan las imágenes se ve claramente que el


montaje fue movido, pero el resultado de la caja de
Petri con ASD presenta un mayor crecimiento de
hongos, por las características de crecimiento y
posición, aparentemente NO SON ENDÓFITOS sino
EPIFITOS. En el de AN se alcanzan a observar
colonias de bacterias también.

Este crecimiento de epifitos y no endófitos como se


esperaba se puede deber a fallas de montaje o
impresión, sin embargo, se observaron crecimientos de
colonias sobre todo en el montaje con ASD.
Ya en la observación con microscopio se evidencia:
● Color violeta luego de tinción con características
de Gram negativas.
● En una sección fue imposible contar las colonias
por lo pequeñas.
● La cantidad de colonias medianas que se
pudieron contar fueron de 26
● La cantidad de grandes colonias de microorganismos que se pudieron
contar fue de 12
● Se alcanzan a observar bacilos y cocos. Por la forma de algunos.
● Importante cumplir con todos los protocolos y procedimientos para que no
se presenten errores como el sucedido en esta estación.
Conclusiones Generales

● Se logró realizar la observación microscópica de los hongos, cuando se


estudian los hongos se pudo observar dos grandes grupos, los patógenos
(moho), y otros en forma de colonias húmedas (levaduras).

● Se menciona los factores físicos y químicos, los cuales tienen un efecto


notable sobre la vida de los microorganismos en su medio ambiente natural
(control y crecimiento bacteriano).

● Se realizó la inoculación de medios de cultivos para la recuperación,


mantenimiento o aislamiento de microorganismo, donde cada muestra se
absorbieron durante un tiempo establecido, algo muy favorable para el
crecimiento de los microorganismos sembrados fuera mayor.

● Por medio de esta práctica de laboratorio concluimos y comprendimos


cuales son los procesos únicos para identificar diferentes tipos de
microorganismos, sus procedimientos, consecuencias, tratamientos y
aplicaciones necesarias en nuestra carrera como Ingenieros Ambientales.
Referencias Bibliográficas

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Facultad de farmacia. Universidad de salamanca.:
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