ALGORITMO DE TRABAJO EN MICROBIOLOGIA

Para estudiantes de análisis clínico / 2019-2020

El laboratorio de microbiología clínica desarrolla actividades orientadas fundamentalmente

al diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas, mediante exámenes
microscópicos directos y por cultivos, aislamiento, identificación y determinación de la
sensibilidad o resistencia del agente infeccioso a los diferentes antibióticos. Demostrar la
presencia de anticuerpos evocadores de la presencia del agente etiológico en cuestión.
Brindar apoyo especializado al Comité de Prevención y Control de las Infecciones
Nosocomiales originadas en el hospital u otro establecimiento de atención de salud.

Para un diagnóstico adecuado se deben seguir determinados pasos en la investigación

microbiológica.

1- Obtención de muestras: Tener en cuenta requisitos generales y específicos,

conservación y transporte.

2- Examen directo: procedimientos técnicos y requisitos para su observación. Tener en

consideración la Preparación de muestras en láminas para examen microscópico en
Fresco y Preparación en láminas de muestras coloreadas

3- Siembra e incubación: procedimiento que incluye medios de cultivos, instrumentos de

siembra y métodos de siembra.

4- Lectura e Informe del resultado.

5- Antibiograma

I- TOMA DE MUESTRAS

La orientación adecuada a los pacientes sobre la obtención de la muestra es un requisito

fundamental a la hora de realizar un diagnóstico de calidad. Él médico y el técnico deben
tener conocimientos sobre los requisitos generales y específicos en la recolección de las
muestras, para poder orientar adecuadamente a los pacientes y obtener una garantía de
calidad en sus diagnósticos.

 REQUISITOS GENERALES:
 Muestra representativa del proceso infeccioso:
Para que el diagnóstico de laboratorio sea fidedigno, es indispensable que las
especies patógenas que se encuentran en los líquidos corporales, tejidos, etc.
 del paciente sean las mismas que contiene la muestra y su cuantía
relativamente proporcional, pero existen factores y procederes como: la demora
en realizar la siembra, inadecuados métodos de conservación, la insuficiente o
excesiva cantidad de muestras a utilizar para el cultivo, la mala calidad de su
obtención y la no observancia de las precauciones de asepsia, que pueden
afectar la viabilidad del germen y en otros su cuantía afectando la calidad de
los resultados al perder la muestra representativa.
 Cantidad y calidad de la muestra:
Utilizar la cantidad normada según el tipo de muestra, ya que pueden afectar la
calidad de los resultados. Para que la muestra sea de buena calidad, debe
tenerse en cuenta en algunas ocasiones el momento idóneo(ejemplo, muestras
como el esputo, debe ser recogido por el paciente, en ayunas, al levantarse,
que es el momento en que mayor cantidad de expectoración se encuentra
acumulada) y en general delimitar con precisión el área anatómica para su
obtención.
 Rapidez y conservación de la muestra:
El envío al laboratorio de microbiología debe ser lo más rápido posible con
objeto de asegurar la supervivencia de microorganismos de difícil crecimiento y
de evitar el sobrecrecimiento de la microbiota normal, de no ser posible utilizar
métodos de conservación según lo normado(Refrigeración a 4°C, Incubación a
37° C, Medios de transporte, Formol al 10 %.)
 Precauciones de asepsia:
Son las acciones encaminadas a evitar que la muestra se contamine durante
su obtención, con especies microbianas ajenas al proceso infeccioso.
 Suspender tratamiento antimicrobiano:
Sistémico 48 horas antes de la toma de la muestra, local al menos 12horas
antes de la toma de muestra.

II- EXAMEN DIRECTO

Para la realización del examen microscópico, las muestras a investigar deben ser
preparadas previamente sobre láminas portaobjetos escrupulosamente limpias, sin
rayaduras ni manchas. El procedimiento a emplear para el montaje de las muestras en
láminas, variará en dependencia de los objetivos que se pretenden con la microscopía y
de la muestra de que se trate. En los exámenes microscópicos, esencialmente se
pretende observar: la morfología de los microorganismos y/o sus diferentes estructuras, la
manera de agruparse y sus afinidades tintoriales, así como, detectar la presencia de
células, leucocitos y otros elementos de interés como pueden ser, larvas, huevos de
helmintos, etc.

a)Preparación de muestras en láminas para examen microscópico en fresco

Para la realización de este montaje, la muestra a emplear se utiliza, tal y como se obtuvo,
sin la adición de ningún reactivo, ni procesamiento previo, aunque en ocasiones resulta
pertinente centrifugarla para concentrar los elementos, que presuntivamente contiene y
facilitar su localización durante la realización de la microscopía.

Procedimiento:

1. Deposite una gota de la muestra en el centro de la lámina portaobjetos.

2. Coloque sobre la gota de la muestra o sedimento una lámina cubreobjetos. Si el
volumen de la gota fue el adecuado, debe quedar, exactamente debajo de toda el
área del cubreobjetos. Si quedara algún espacio sin cubrir se incurriría en error por
defecto, debido a insuficiente cantidad de muestra y si se derrama por fuera del
cubre objetos, el error en el montaje sería por exceso. En ambos casos se debe
repetir el montaje. Para evitar que queden espacios con burbujas de aire, la
colocación del cubreobjetos debe efectuarse suavemente.

b) Preparación en láminas de muestras coloreadas

Este método se utiliza cuando se requiere teñir a los microorganismos y/o su entorno,
para su mejor observación o para determinar sus afinidades tintoriales. se efectúa por dos
procederes diferentes: la adición del colorante a la muestra o la preparación de frotis.

Adición de colorantes a la muestra

La muestra es emulsionada con el colorante antes de ser colocada la lámina

cubreobjetos.

Preparación de frotis

El frotis consiste en una extensión de la muestra con hisopo o asa de platino sobre la
lámina portaobjetos, de manera que al sacarse quede formando una capa.

Procedimiento:
  Frotis de muestra o el cultivo líquidos: deposite sobre la lámina portaobjetos una
cantidad suficiente, que le permita hacer un frotis grueso con ayuda de un asa
de platino estéril.
 Frotis de colonia germinada en medio de cultivo sólido: echar previamente en el
centro de la lámina portaobjetos una gota de solución salina fisiológica y
posteriormente emulsionar la colonia con un asa de platino estéril con la que se
hará la extensión fina.
 Después de realizado el frotis, déjelo sobre la mesa de trabajo hasta que se
seque. Si desea acelerar este proceso
 Una vez seco el frotis, tome la lámina por los bordes con los dedos índice y
pulgar, de manera que la extensión quede hacia arriba. Pase la lámina
directamente por la llama del mechero dos o tres veces para fijar. La exposición
al calor directo provocará que las estructuras de naturaleza proteíca, se
coagulen, lo que inducirá que la preparación quede adherida a la lámina y no
sea desprendida después de la coloración por el agua que se utilice para
eliminar el exceso de colorante.

COLORACIÓN DE GRAM

En 1884, el danés Hans Chistian Gram, ideó un método de coloración, que es en la

actualidad, el más empleado en los laboratorios de bacteriología, mediante el cual, la
bacteria sometida a esta tinción, en dependencia de la composición químico de la
especie, queda teñida de color violeta o de color rojo.

Colorantes

1.Cristal violeta

2. Lugol de Gram.

3. Alcohol etílico

4. Solución de Safranina al 1 %

Procedimiento

Después de fijado el frotis a la llama del mechero, colocar la lámina sobre el puente de
coloración.

1. Verter la solución de cristal violeta, hasta cubrir el frotis, dejando que el colorante actué
por espacio de 30 segundos.
2. Lavar la preparación ligeramente con agua corriente.

3. Echar sobre la preparación el lugol de Gram., hasta cubrir el frotis dejando que actué
durante 30 segundo.

4. Lavar la lámina con agua corriente.

5. Echar sobre la preparación el alcohol etílico, 1minuto.

6. Lavar la lámina con agua corriente.

7. Echar sobre la preparación la solución de safranina, dejándola actuar por espacio de 30

segundo.

8. Lavar con agua corriente.

Secado de lámina

Al concluir el proceso de coloración, la lámina se debe colocar de canto para que se

escurra

Fundamento técnico

En el primer paso de la coloración, cuando los microorganismos presentes en el frotis son

expuestos a la acción del cristal violeta, todos los géneros que se encuentran en el frotis
se tiñen de color violeta. Al adicionar el lugol, que es un mordiente o fijador forma un
complejo violeta-lugol, para fijar el color en la bacteria. Al adicionar el decolorante
algunos microorganismos no son afectados, reteniendo por consiguiente el color violeta
aplicado inicialmente, en tanto que otros son decolorados quedando la bacteria
nuevamente incolora. Al echar finalmente la solución de safranina (que es de color rojo)
tiñe de rosado los microorganismos que fueron decolorados por el alcohol

Diagnóstico microscópico

Las bacterias que se observan de color violeta se clasifican como Gram positivas y las
que se observan de color rosado, como Gram negativas.

COLORACIÓN DE "ZIEHL NEELSEN

Algunos géneros microbianos dentro de los que se incluyen las

microbacterias, tienen la propiedad de retener el colorante con que han sido

teñidas, aunque sean sometidos a la acción de solventes tan fuertes como los
ácidos para su decoloración, el primer método de coloración para este tipo de

microorganismo, fue concebido y aplicado por Robert Koch, descubridor del

agente causal de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis o Bacilo de Koch.

Fue modificada y perfeccionada posteriormente por Ziehl y Neelsen. Este método

se utiliza hoy en dia, con alguna que otra modificación en función de las

particularidades de la especie en estudio.

Colorantes

1.Fucsina básica(fenicada)

2. Alcohol clorhidrico al 3 %

3. Azul de metileno

Procedimiento:

Después que el frotis se ha secado colocar la lámina sobre el puente de coloración.

1. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y oscilar suavemente la llama del mechero por
debajo de la lámina, hasta que el colorante calentado comience a emitir vapores. Retirar
el mechero y dejar que el colorante actué sobre el frotis por espacio de 5 minutos. Si en
ese tiempo el colorante se secara, añadir más, pero sin volver a calentarlo.

2. Verter el exceso de colorante de la lámina, ladeando la lámina y lavarla con agua

corriente.

3. Echar sobre frotis la solución de alcohol clorhídrico 3% o en su defecto la solución

acuosa de ácido sulfúrico20%, dejando actuar el decolorante, hasta que se observe que el
solvente no extrae mas colorante de la preparación.Esta operación debe durar
aproximadamente unos 2 minutos.

4. Lavar la lámina con agua corriente.

5. Añadir la solución acuosa de azul metileno, dejando actuar el colorante 30 segundos

6. Lavar la lámina con agua corriente.

7. Dejar que la lámina se seque al aire sin aplicar papel de filtro para acelerar el secado.

Principio:

Las microbacterias, como el Mycobaccterium tuberculosis y otras especies susceptible de

ser coloreadas por esta técnica, se caracterizan por tener una alta proporción de ácido
micolico (lípidos) en su pared celular. La acción del calor, introducido en este método,
hace que la misma se permeabilice y haga accesible la penetración de la fucsina,
tiñéndose la pared celular. Al normalizarse la temperatura de la preparación, el compuesto
lipidico impermeabiliza la pared a la acción del decolorante ácido, con lo cual el
microorganismo se mantiene teñido. El resto de las especies, así como las células
epiteliales y otros artefactos, que no disponen de ácido micólico en su pared o membrana,
son decolorados, después de teñidos por la fucsina.

Fundamento técnico

Al someter el frotis a la acción de la Fucsina, todos los microorganismos,

independientemente de que dispongan o no de ácido micolico en sus respectivas paredes
celulares serán coloreados de rojo. Al aplicar el decolorante ácido, las especies que
posean el ácido micolico en la pared, resisten la acción decolorante y se mantienen
teñidas de rojo, en tanto que las demás se quedan incoloras. Al aplicar la coloración de
contraste (azul de metileno) las bacterias que retuvieron el color proporcionado por la
fuscina, no sufren ninguna alteración permaneciendo de color rojo, pero las especies que
si fueron decoloradas, se tiñen de azul, al igual que las células epiteliales y otros
artefactos presentes en la preparación.

Diagnóstico microscópico

Los bacilos que se observan coloreados de rojo están diagnosticados como B.A.A.R.
(Bacilos ácidos alcohol resistentes).

III-SIEMBRA E INCUBACIÓN

La siembra microbiológica es un procedimiento técnico que consiste en colocar una

pequeña fracción o volumen de la muestra, sobre o dentro, de uno o varios medios de
cultivo que contengan los nutrientes necesarios para las microorganismos que
presuntivamente contiene, con la finalidad de que puedan desarrollarse adecuadamente,
para facilitar su estudio y posterior identificación. El número de células microbianas que se
encuentran en el volumen o fracción sembrada se denomina inóculo.
Los instrumentos de siembra son los objetos empleados para tomar el volumen o fracción
de la muestra y sembrarla en el medio de cultivo.

Instrumentos de siembra: a) Asa de platino; b) Aguja de platino; c) Espátula de Drigalski;

d) Pipeta; e) Hisopo

El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se pretendan alcanzar

con el cultivo, los más empleados son los siguientes:

1. Siembra por estrías. se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo sólidos
distribuidos en placas de "Petry" o en tubos de ensayo solidificados en forma de cuña.
(Slam), se utiliza el asa de platino

2. Siembra por punción. la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el

medio de cultivo.

3. Siembra volumétrica. Depositar un volumen de líquido en medio solido

4. Siembra masiva. la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la
superficie del medio de cultivo sólido imprimiéndo un movimiento en espiral, se utiliza la
espátula de Driglaski.

Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrón, deben ser

calentados en la llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después de realizar la
siembra, con el objetivo de destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie
del instrumento.

Con independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplear ésta debe
realizarse en las proximidades de la llama del mechero ya que el calor emanado reduce el
número de microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un
recurso a favor del proceder aséptico.

INCUBACIÓN

Una vez realizada la siembra, atendiendo a los requerimientos de los microorganismos

que presuntivamente se encuentran en la muestra, se debe proporcionar a los cultivos la
temperatura y las condiciones de aereación que favorezcan su desarrollo, durante un
tiempo predeterminado que será variable para cada grupo de microorganismo.

IV-LECTURA E INFORME

Depende del crecimiento en los medios de cultivos

En medios de cultivo líquidos: En general el crecimiento se manifiesta por turbidez, la

cual podrá opacar todo el cultivo o darle un aspecto granuloso o nebuloso.

En medios de cultivos sólidos

Como la bacteria se encuentra impedida de desplazarse por la solidez del medio,al

multiplicarse en un punto especifico, sus descendiente que alcanzan magnitudes
millonarias en menos de 24 horas, ocasionan agregados bacterianos, que dan lugar a
estructura visibles de diferente formas, aspecto y colores, denominados colonias
bacteriana cuyos caracteres serán típicos para cada género o especies.

V-ANTIBIOGRAMA
La prueba que se realiza para conocer la resistencia y sensibilidad de los
microorganismos frente a los antimicrobianos.

ALGORITMO DE TRABAJO EN LA INVESTIGACIÓN MICROBIOLÓGICA DE

ALGUNAS MUESTRAS

a) Exudado vaginal.

1- Obtencion de la muestra:
 Indicaciones específicas: Suspender cualquier terapéutica por vía local 2 o 3 días
antes de que le sea tomada la muestra. Debe concurrir al laboratorio sin previo
aseo vaginal desde la noche anterior, aunque puede, efectuar lavado matutino de
genitales eternos. Se recomienda no realizar coito vaginal en ese periodo de
tiempo.

Procedimiento: Se le indicará a la paciente que se desnude de la cintura hacia abajo y

se acueste en posición de cúbito supino (boca arriba) sobre una camilla con estribos,
adoptando una posición ginecológica (las corvas sobre los estribos y los glúteos muy
próximos al borde de la camilla). Seguidamente se procederá a insertar un espéculo
estéril de tamaño conveniente sin lubricantes, ya que puede ser tóxico para algunos
microorganismos. En los casos de niñas se realiza un exudado vulvar y en pacientes
vírgenesse realiza también un exudado vulvar. A continuación se procede a introducir un
hisopo estéril hasta el fondo del saco posterior de la vagina y paredes, el cual será
embebido con el exudado. Al momento de tomar la muestra se realiza la medición del pH

al exudado. Introducir el hisopo inmediatamente en un tubo con 1 ml de solución salina

estéril.

Conservación y transporte.

• Si la muestra no es examinada de inmediato, se mantiene en el tubo con solución salina.

Examen microscópico: procedimientos técnicos.

• Identificar una lámina portaobjeto por el lado opuesto a la muestra.

• Centrifugar( 5minutos a 1500 rpm) el tubo con solución salina, decantar y colocar el
sedimento entre cubre y portaobjeto.

• Observar con objetivo de 40x,

Puede observarse

- Células levduriformes: son células ovales, capaces de emitir un brote o yema

(gemante) conocido como blastospora o blastoconidia, que se mantienen unidas
formando un filamento llamado seudohifa.

- Células guias (aparecen cuando se sospecha de Gadnerella vaginalis, es uno de

los cuatros requisitos de acuerdo a los criterios de Amsel: Secreción vaginal blanco
grisácea maloliente, pH por encima de 4,5, Presencia de células guías, Olor a
pescado al añadirle a la secreción (sedimento en el tubo centrifugado) de dos a
tres gotas de KOH al 10%.
- Polimorfos nucleares
- Linfocitos
- Parasitos(Trichomonas vaginalis, huevos de enterobius)
- Células epiteliares

UROCULTIVO

Objetivos

• Determinar la presencia de uropatógenos en la muestra de orina.

Toma de muestra:
Requisitos específicos:

1. De ser posible las muestras para el urocultivo deben recolectarse en el propio

laboratorio, de lo contrario, garantizar el traslado de la misma en un ambiente fresco
(vasija con hielo), en un período no mayor de 1 hora.
- Recordar que: En pacientes con problemas para orinar, como enfermos
inmovilizados u obesos con obstrucción urinaria, recién nacidos o niños pequeños,
se realizará sondaje o punción suprapúbica.
2. Aseo de los genitales con agua y jabón, esto debe hacerse de pie, no sentado, para
evitar que el agua que corra vuelva a contaminar los genitales.
3. Enjuagar con solución yodada estéril al 1%, la cual al cabo de 1 minuto garantiza la
desinfección de la zona externa de los genitales, de gérmenes contaminantes.
4. Depositar la muestra correspondiente a la primera orina de la mañana en un frasco
estéril,con tapa y retapa, desechando el primer chorrito y el último, es decir recoger
chorrito intermedio (15 ml aproximadamente), el objetivo de esta acción es arrastrar
los posibles agentes contaminantes que se encuentren en la uretra.
5 Si en el laboratorio no puede sembrarse antes de las 2 horas, será conservada a 4ºC,
antes de proceder a la siembra.

Procedimiento Siembra e incubación

• La siembra se realizará con pipeta Ependorf, preferiblemente calibrada de 5 μL,

utilizando puntas estériles, colocando el inóculo sobre la superficie del medio de cultivo
empleado. La siembra debe realizarse en medios diferenciales, como es el medio CLED
(agar cisteína lactosa deficiente en electrolitos). Se extiende el inóculo masivamente con
espátula de drigalski y se coloca en incubadora a 37ºC durante 24 horas para la
realización de la lectura visual.
En casos necesarios pueden ser utilizados otros medios de cultivo como el agar sangre o
Mac Conkey.

Lectura e informe
 Si no hay crecimiento en la placa, se informa como: Sin crecimiento bacteriano.
 Si el crecimiento resultara de más de dos tipos de colonias, entonces se informará
como muestra contaminada.
 menos de 50 colonias, se informa: menos de 10000ufc/ml,(esto es negativo)
 Mas de 500 colonias, se informa: mas de 100 000 ufc/mL, informando el patógeno
aislado y su correspondiente antibiograma.
 Si el crecimiento se encuentra entre 50 y 500 ufc/mL sobre la placa del cultivo, se
cuenta la cantidad de colonias y se multiplica por 200, informar el No
obtenido/mL/orina e identificar el microorganismo y realizar antibiograma.

Cálculo e interpretación de los resultados

• Al sembrar 5 μL (0.005 mL) de la muestra de orina, se realiza el conteo dividiendo la
superficie de la placa en 4 cuadrantes. El número de colonias que aparecen en el
cuadrante promedio se multiplicará por 200 (para llevar a equivalencia a 1 mL) y después
por 4. La cifra resultante corresponde al número de unidades formadoras de colonias por
mililitro (UFC/mL), en cultivo puro de la cepa responsable de la sepsis urinaria.

Identificación de los microorganismos

Tener en cuenta:

 Aspecto y características morfológicas de las colonias.

 Características microscópicas y tintoriales

 Estudio fisiológico de las cepas (Pruebas bioquímicas y enzimáticas)

Si tienen aspecto de gram positivas ( colonias pequeñas, cremosas, secas) se les

puede hacer prueba de catalasa, si esta da positiva, verificar morfología en
racimos, hacer prueba de coagulasa si da positiva es Estafilococcus aureus.

Germenes Gram positivos: Estafilococcus aureus, Enterococcus

Si las colonias tienen aspecto de gram negativas (grandes, húmedas, ) hacer

pruebas bioquímicas.

Germenes Gram negativos: Escherichia coli, Klebsiella pneumoneae, oxytoca,

Proteus, Enterobacter, Pseudomonas