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Universidad Nacional Autónoma de México.

Facultad de Química. Bioquímica Experimental. Depto. De Bioquímica.
Titulares: Dr. Ávila Chávez Euclides / Dra. Mendoza Rodríguez Carmen Adriana.

«Purificación de proteínas asistido por el software ProtLab»

Por: Carrizosa Muñoz Cecilia1 / Chavira Tapia Juan Miguel2 / Hernández Benítez Luis Joshua3 / Torres
Santander Fernando.4

Resumen termoestabilidad de la proteína, mientras que la

Introducción: Para el estudio de una proteína y el columna de intercambio iónico utilizada fue bajo la
rol biológico que desempeña, es necesario utilizar previa noción del pH al cual la actividad enzimática
técnicas de aislamiento que permitan su purificación de la proteína es estable.
sin haberla destruido, dichas técnicas se basan en Conclusiones: La consideración de las propiedades
métodos tanto físicos como químicos considerando tales como el punto isoeléctrico de una proteína, así
las propiedades fisicoquímicas que poseen las como su termoestabilidad, son la pauta para poder
proteínas. llevar a cabo métodos que contribuyan a la obtención
Objetivos: Identificar el método que provea un buen de un alto rendimiento, además de optimizar costos
rendimiento en la obtención de la proteína 20 bajo y reactivos durante la obtención de una proteína.
una purificación simulada, tomando en cuenta las
propiedades físicas y químicas de la proteína. INTRODUCCIÓN
Material y método: Se utilizó el software ProtLab
Las técnicas de separación y purificación de proteínas
y se escoge al azar la proteína número 20, de la cual
son de gran importancia en los avances del área de las
sólo se proporciona las condiciones de temperatura y
ciencias biológicas y de la biotecnología, pues de esta
pH a la cuál su actividad enzimática es estable; a
manera se puede conocer la función que éstas poseen en las
partir de lo cual se procede a aplicar primero un
células (ya sea estructurales, enzimáticas, de transporte,
método físico (tratamiento con calor) para concluir
entre otras). Las técnicas de purificación se basan en las
con una cromatografía de intercambio iónico, la
propiedades físicas y químicas de estas moléculas, e
presencia de la proteína se verifica con una
implican la separación de una proteína de una mezcla de
electroforesis en gel de poliacrilamida.
moléculas con características similares donde la proteína de
Resultados y discusión: Se logró purificar la
interés constituye una mínima fracción.
proteína 20 con un rendimiento del 100%. El
tratamiento con calor se utilizó al tener en cuenta la

Contacto.
Equipo 5:
1
crmcecilia@gmail.com
2
mivader.25@gmail.com
3
lujo_hebe@outlook.com
4
fernando061095@gmail.com

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Por esto, es necesario aprovechar las características que OBJETIVOS

diferencian a unas proteínas de otras, como pueden ser su
tamaño y forma, masa molar, carga neta, punto isoeléctrico, Conocer los fundamentos y la correcta utilización de los
hidrofobicidad, su interacción con iones metálicos, métodos físicos y químicos más comunes para la
solubilidad, termorresistencia, entre otras. purificación de una proteína.

Las técnicas que sirven para separar y purificar Utilizar las características físicas y químicas propias de
proteínas pueden ser de precipitación, adsorción, una proteína para su eficaz separación y purificación.
electroforéticas, y cromatográficas; cada una de estas tiene
sus variantes, que se basan y se eligen dependiendo de las
propiedades de la proteína que se desee purificar. Para las MATERIAL Y MÉTODOS
técnicas de precipitación existen agentes precipitantes que La parte experimental de esta práctica se llevó a cabo
pueden ser cationes y aniones; las técnicas cromatográficas mediante el uso del software Protein Purification
se efectúan con filtración en gel, columnas de intercambio desarrollado por la Facultad de Ciencias Biológicas de la
iónico, columnas de interacción hidrofóbica o covalentes, Universidad de Leeds; el cual se encuentra disponible vía
entre otras; para la electroforesis se encuentra de una online en la dirección http://www.agbooth.com/pp_ajax/.
dimensión (basada en el tamaño molecular de la proteína)
La metodología empleada para la purificación de la
o de dos dimensiones (basada en tamaño molecular y punto
proteína 20 se llevó a cabo en dos pasos; el primero
isoeléctrico de la proteína en cuestión).
consistió en un tratamiento con calor el cual se aplicó a
Actualmente se cuenta con un gran número de técnicas 60°C durante 60 minutos. En el segundo paso se utilizó una
de separación y purificación de estas moléculas de suma columna de intercambio iónico de DEAE – Celulosa
importancia biológica, pero el problema real y limitante utilizando un gradiente de sal (0.0 – 0.5 M) como método
reside en conocer qué técnica utilizar en base a las de elución, en presencia de un buffer de pH = 6.6.
propiedades de la proteína deseada. De igual manera es De la columna de intercambio iónico se utilizaron las
necesario conocer y tener sumamente controladas las fracciones 40 – 55 las cuales mediante un ensayo
condiciones de extracción de la proteína del medio donde enzimático se corroboró la presencia de la enzima 20,
se encuentra (intracelular o extracelular), y una vez extraída obteniéndose así la enzima antes mencionada purificada
mantener en las condiciones adecuadas para conservarla con un rendimiento del 100,0 %.
funcional y poder corroborar su purificación y rendimiento
final del proceso.
RESULTADOS
En la Tabla 1 se observa la metodología empleada para
HIPÓTESIS la purificación de la enzima 20, detallando la cantidad de
proteína restante después del uso de cada metodología así
Si se emplean las técnicas de purificación adecuadas como el rendimiento de purificación de la enzima.
(seleccionadas en función de las propiedades químicas y
físicas de la enzima 20) entonces se espera obtener un alto En la Figura 1 se muestra el avance de la purificación de
rendimiento en la purificación de esta enzima. la enzima 20 y en la Figura 2 se confirma la presencia de la
enzima 20 purificada.

Tabla 1. Purificación de la proteína 20 de una muestra “default”.

Método Proteína (mg) Enzima (IU) Rendimiento (%) Enriquecimiento Costo (h/100U)
Inicial 511 5400 100 1,0 0
Calor 69,3 5400 100 7,4 0,019
Intercambio iónico 18,5 5397,4 100 27,4 0,148

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Figura 1. Purificación de la enzima 20. Se muestra el avance de la purificación de la enzima 20 partiendo de la muestra inicial (a),
de la fracción de las proteínas después del tratamiento con calor (b) y la fracción purificada en la resina de intercambio iónico DEAE
– Celulosa (c). Donde Mr es un marcador de masa molar de referencia.

Figura 2. PAGE de la enzima 20. Se muestra la confirmación de la enzima 20 purificada, dicha muestra proviene de la fracción
purificada tras el tratamiento con la resina de intercambio iónico.

DISCUSIÓN
La primera técnica realizada fue el tratamiento con
calor, pues se nos mencionó que la proteína soportaba
temperaturas altas de hasta 60°C. Como la estabilidad
térmica de las proteínas es variable (según su función y su
sitio de acción) se aprovechó su termoestabilidad ya que las
proteínas termosensibles se desnaturalizan perdiendo su
estructura funcional facilitando así la purificación de la
proteína de interés. Esta técnica es útil para las proteínas
termoestables ya que permite su separación de proteínas
termolábiles.
La otra técnica utilizada en la purificación de la proteína
en estudio fue una cromatografía con una columna de
intercambio iónico. El fundamento de esta técnica son las
interacciones electrostáticas entre las proteínas de la
muestra y los grupos cargados de la columna. Para esto, los

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aniones de las proteínas se unen a los grupos catiónicos somete a una electroforesis a través de una solución o un
intercambiadores de aniones de columna, o viceversa, los gel que tiene un gradiente de pH estable que aumenta desde
cationes se unen a los grupos aniónicos intercambiadores el ánodo al cátodo, y cada proteína migrará donde el pH
de cationes de la columna. Para poder conocer qué columna coincida con su pI (Voet, 2007).
utilizar es necesario conocer el punto isoeléctrico de la
proteína para saber a qué pH trabajar en la columna y de Este tipo de electroforesis nos ayuda a visualizar de una
esta manera predecir si la proteína se encontrará carga mejor manera la separación de nuestra proteína de las
positiva o negativamente, y así, si la columna a utilizar será demás, pues no únicamente es en base a su peso molecular,
intercambiadora de aniones o cationes. sino también a su punto isoeléctrico. Con base en esto, y si
la proteína no está separada completamente y observando
El punto isoeléctrico (pI) de una proteína nos indica el su posición dependiendo del pH y su peso molecular, se
valor de pH al cual la proteína se encuentra neutra, es decir, puede optar por una cromatografía por columna de
sin carga. A pH menores a este, la proteína se encuentra intercambio iónico o por una filtración en gel para
cargada positivamente, y a pH mayores se encuentra continuar con la purificación.
cargada negativamente (en el pI influyen en gran cantidad
los residuos de aminoácidos que posee la proteína, y si son Después del tratamiento del calor y la cromatografía de
ionizables o no, donde cada uno posee un pKa distinto) intercambio iónico realizada a la muestra proteica, se
(Sheehan, et al. 2001). visualizó la purificación de esta mediante un PAGE de dos
dimensiones, corroborando que la proteína se encontraba
Nuestra proteína de estudio es estable a valores de pH pura.
de entre 4 y 11.5, por lo que el valor de pI debía encontrarse
en ese rango, y posiblemente en un valor intermedio. CONCLUSIONES.
Entonces, se trabajó a un pH de 6.6, pues la proteína se Las propiedades físicas y químicas propias de una
encontraría cargada negativamente, por lo tanto, se utilizó enzima son de vital importancia, ya que a partir de éstas se
una columna intercambiadora de DEAE – Celulosa ya que seleccionarán los métodos más adecuados para su
al contener una amina terciaria como grupo ionizable a pH separación y purificación de una mezcla proteica o
neutro y menores se encontrará cargada positivamente y fisiológica con los mayores rendimientos posibles.
podrá cumplir la función de intercambiador de aniones.
(Sheehan, et al. 2001). Los métodos de aislamiento se deben escoger de tal
manera que la proteína no se desnaturalice ni se afecte su
Para corroborar la separación correcta de la proteína se composición química, ya que al buscar una proteína de
corroboró su actividad enzimática, y se separaron las interés, se busca obtener grandes cantidades de ella para su
fracciones donde resultó positivo a dicha actividad para posterior estudio enzimático por ejemplo.
realizar su posterior electroforesis. La electroforesis
realizada se llevó a cabo de un gel de poliacrilamida REFERENCIAS
(PAGE). La primera electroforesis realizada fue de una vía
- García Pérez, Hilda Marilin. “Electroforesis en
o una dimensión, donde se separan las proteínas en base a
geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad
su peso molecular. El peso de las moléculas se determina al
e importancia”. UNIV DIAG 2000; 1 (2): 31-41.
comparar la movilidad de estas en el gel con varios
- Janson, Jan-Christer. “Protein Purification:
marcadores de peso molecular conocido (conociendo su
Principles, High Resolution Methods, and
peso es posible realizar una filtración en gel). Al realizar
Applications”. 3a Edición. Vol. 54. Editorial Wiley.
este tipo de electroforesis es posible ver las proteínas que
EUA, 2011. Págs. 4-10
aún están presentes en nuestra muestra mediante bandas
- Sheehan, D., O’Sullivan, S. Ion Exchange
separadas, debido a la previa tinción de éstas, como por
Chromatography. Encyclopedia of life sciences.
ejemplo, con azul brillante Comassie. El pH del gel es de
John Wiley & Sons Ldt, 2001. Págs. 1-4.
aproximadamente 9, por lo que las proteínas poseen carga
- Voet, Donald; et. al. “Fundamentos de Bioquímica.
negativa y migran hacia el ánodo.
La vida a nivel molecular”. 2ª Edición. Editorial
Al observar que se tiene separada una banda de todas las Médica Panamericana. España, 2009. Págs. 98, 101-
demás o si únicamente observamos una banda, no podemos 103, 105-107.
asegurar que es la única en la muestra presente. Por ello, se - Software utilizado disponible en:
realiza la electroforesis en dos dimensiones, La mezcla se http://www.agbooth.com/pp_ajax/

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