Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
OPERACIONES UNITARIAS I

ACTIVIDAD DE LA UNIDAD II

BIOSEPARACIONES

Nombre del alumno:

Victoria Méndez Adán

Numero de control:

20270427

Grupo: B6A

Docente

Javier Ramírez Diaz

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, México, a 02 de junio 2023.

 BIOSEPARACIONES

En los procesos biotecnológicos se realizan dos procesos fundamentales. El

primero corresponde a los procesos biológicos para la formación del producto y el
segundo a las operaciones necesarias para su separación. Al conjunto de éstas
últimas se les conoce como bioseparaciones y son las más importantes después de
la fermentación. Su importancia se debe a que representan hasta un 60% del costo
de la producción total dependiendo del grado de pureza, el origen y destino del
producto.

Los procesos de bioseparación pueden describirse en cuatro etapas: primero la

remoción de insolubles, que consiste en clarificar el caldo que sale del fermentador
mediante operaciones de filtración o centrifugación; el aislamiento del producto o
concentración del mismo utilizando cualesquiera de las siguientes operaciones:
evaporación, ultrafiltración, ósmosis inversa, precipitación y destilación, entre otras;
la tercera sección es purificación, la cual depende de las características del producto
que se desea obtener e involucra operaciones de extracción con solventes o
diferentes tipos de cromatografía; por último, se tiene la sección de acabado, con
operaciones como la cristalización, secado o liofilizaci6n, que se utilizan para
garantizar la esterilidad y estabilidad del producto.

Todas las operaciones de separación se basan en las diferencias que existen en las
propiedades fisicoquímicas de los compuestos del caldo de cultivo y su secuencia
depende de la naturaleza del producto, si es intracelular o extracelular. Para hacer
una buena selección del proceso de bioseparación, se deben considerar las
características del producto y los aspectos tanto técnicos como económicos, para
lograr procesos cada vez más eficientes a menor costo (Belter y col.,1988).

OPERACIONES TÍPICAS EN UN PROCESO DE BIOSEPARACIÓN

Los procesos de bioseparación, involucran algunos pasos de recuperación y

purificación de productos provenientes del biorreactor. Comprenden todos los
tratamientos que requiere el caldo de cultivo para la obtención del producto en 'las
condiciones de pureza y actividad deseadas.

1. Selección del proceso de bioseparación

La selección del proceso de separación involucra, desde el principio, la toma de

decisiones sobre el grado de pureza exigido al producto y la concentración en la
que se desea obtener el mismo. Se deben considerar tres conceptos muy
importantes en la selección de un esquema de
Purificación de cualquier producto:

A. Grado de pureza deseado

B. Fuente u origen del producto y
C. Estrategia de purificación

La fuente de la proteína enzimática se determina según el objetivo que se pretende,

la cantidad de enzimas o enzimas seleccionadas que se desea obtener. Sin perder
de vista la disponibilidad y el potencial de reproducción de la fuente seleccionada.
una vez fijadas la fuente de la proteína y el nivel de purificación deseados es
necesario seleccionar el método o los métodos que nos permitan conocer el estado
de purificación de la proteína (Giral, 1987).

2. Operaciones en productos intracelulares

En la naturaleza, la mayoría de las enzimas y de las proteínas se localizan en las

células biológicas, dentro de éstas, la mayoría de las enzimas y proteínas se
subdividen en pequeños sistemas inmovilizados de organelos intracelulares, es por
esto que la primera alternativa que se nos plantea en un esquema de purificación
es la posición de la proteína; si está dentro de la célula o es excretada al medio
extracelular. (Giral, 1987).

COSECHA DE CÉLULAS. El primer paso en un proceso para la recuperación de

productos intracelulares es la cosecha de células (Montesinos, 1992). En esta
etapa, es importante considerar el periodo de producción de la proteína, ya que
sería inútil tratar de aislarla antes de, que se produzca, asimismo se deben valorar
las posibilidades de inducción para contar con mayor cantidad (Giral, 1987). La
centrifugación y la filtración por membrana son las únicas técnicas usadas para
cosecha de células a gran escala.

ROMPIMIENTO DE CÉLULAS. El segundo paso en la obtención de los productos

intracelulares es el rompimiento de la célula, esta operación puede realizarse de
distintas maneras:

1. Medios mecánicos: molinos de arena, agitación a alta velocidad con perlas

de vidrio y oscilaciones sónicas.
2. Medios físicos: tratamiento térmico y choque osmótico.
3. Medios químicos: solventes orgánicos y detergentes.
4. Medios enzimáticos: Lisozima, Papalna y la combinación de algunas de ellas
(Asenjo, 1990).

Frecuentemente, el rompimiento de bacterias y levaduras es realizado en

homogenizadores a alta presión o en molino de perlas (Montesinos, 1992).
REMOCIÓN DE DESECHOS CELULARES. Este término se refiere al proceso de
separación de la fracción donde se encuentra la proteína problema después de la
ruptura. Se puede encontrar en la fracción de sobrenadante en forma soluble o
precipitada por lo que la centrifugación es un proceso casi de rutina para la
separación de las dos fracciones que también dependerá de la naturaleza de la
proteína, de la fuerza y el tiempo de centrifugación (Giral, 1987). Otras operaciones
que también son utilizadas son: microfiltración, filtros rotatorios al vacío, filtros
prensa, filtración profunda o extracción.

Cuando se usa la operación de centrifugación a continuación debe efectuarse un

filtrado para eliminar las partículas mds pequeñas las cuales pueden ocasionar
problemas en etapas posteriores como la cromatografía (Montesinos, 1992).

3. Operaciones en productos extracelulares

ELIMINACIÓN DE BIOMASA. La eliminación de biomasa es el primer paso que se

realiza en un proceso de separación, cuando el producto es extracelular. Los
equipos más empleados son: la centrífuga decantadora, los filtros prensa y de
membranas. (Montesinos, 1992).

4. Operaciones de alta resolución

CONCENTRACIÓN. Después de la primera clarificación del caldo obtenido del

biorreactor o una vez rota la célula, el producto se encuentra diluido. En la
concentración de éste las operaciones usadas son: ultrafiltración, extracción,
osmosis inversa, evaporación, precipitación y destilación.

PURIFICACIÓN. Las operaciones de purificación final dependen fuertemente de la

pureza con que se requiere el producto, para productos de alta pureza, las
operaciones de purificación finales son normalmente la cromatografía y la
ultrafiltración. La cromatografía es una operación que se realiza al final de un
proceso, en concordancia con la regla heurística "realizar las separaciones más
difíciles y caras al final". Existen varios tipos de cromatografía entre las cuales se
encuentran: intercambio iónico, filtración por gel y afinidad. (Montesinos, 1992).

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

La purificación de las proteínas es un paso muy importante en su procesamiento.

Para separar una proteína del resto de los componentes que se encuentran en la
célula se utilizan las propiedades características de las proteínas como son la
solubilidad selectiva, comportamiento cromatográfico y peso molecular.
Para todas las etapas de purificación es importante conocer la actividad especifica
de la enzima, es decir la actividad enzimática por miligramo de proteína la cual nos
permite calcular el grado de pureza de la proteína, con el peso total (Burgess, 1987).

𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 =
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

1. Naturaleza del problema

El problema de la purificación de proteínas se comprende mejor cuando se

considera la mezcla de macromoléculas que están presentes en el extracto celular
acompañando a la proteína de interés. Estas otras proteínas están presentes en el
extracto junto con ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos y pequeñas moléculas.
Una proteína especifica podría estar presente por arriba del 10% o por debajo de
una milésima parte del total de proteínas en la célula. El problema de la purificación
de la proteína de interés es la separación de todos los componentes de la célula,
especialmente las proteínas contaminantes no deseadas.

Cuando una proteína es purificada para ser producida a gran escala, el nivel de
purificación depende del producto final; por ejemplo, hay una diversidad de usos de
las proteínas en las que no se requiere que éstas sean

completamente puras, pero también existen otras áreas como las que se dedican a
estudios enzimáticos y estudios químicos de proteínas que requieren preparaciones
de proteínas altamente purificadas, para medir sus bases físicas y algunas de sus
propiedades (Burgess,1987). En la Tabla 1 aparecen los requerimientos de pureza
para diferentes usos de proteínas.
2. Propiedades de las proteínas y su manejo en la purificación

Una de las razones que explica la capacidad que se tiene en un laboratorio para
purificar una proteína de una mezcla es que las proteínas varían considerablemente
en sus propiedades físicas y químicas. La explotación de esta diferencia entre las
proteínas de interés y las demás que se encuentran en la mezcla, permiten diseñar
una serie racional de pasos para su separación. Entre estas propiedades. Se
pueden citar las siguientes:

TAMAÑO Y FORMA. La mayoría de las proteínas varían en tamaño desde péptidos

con pocos aminoácidos y pesos moleculares de cientos de daltons hasta proteínas
de gran tamaño que contienen por arriba de 3,000 aminoácidos con pesos
moleculares por encima de 300,000 daltons. El movimiento de una proteína a través
de la solución durante la centrifugación o a través de pequeños poros en
membranas, lechos, o geles es influenciado por el tamaño, así como por la forma
de la proteína que puede ser globular o bastante asimétrica.

CARGA DE LAS PROTEÍNAS. Se determina por las cargas positivas y negativas de sus
aminoácidos. Si una proteína contiene muchos residuos de ácido aspártico y
glutámico, tendrá una carga neta negativa y puede ser llamada proteína ácida. Por
otro lado, si tiene muchos residuos como lisina, arginina, y en algunos casos
histidina, pueden considerarse proteína básica; obviamente la carga de una
proteína es determinada por el pH de la solución.

PUNTO ISOELÉCRICO. El punto isoeléctrico„ (PI), es el pH al cual la carga neta sobre

la proteína es nula y es determinado por la curva de titulación de las cargas positivas
y negativas de los aminoácidos de las proteínas. El PI de las proteínas
generalmente está en el rango de 4.5 - 8.5.

DISTRIBUCIÓN DE CARGAS. Los residuos de aminoácido cargados se distribuyen

uniformemente en la superficie de la protelna o pueden estar agrupadas de tal
manera que una región sea muy positiva mientras que otra sea muy negativa. Tal
distribución de las cargas puede ser utilizada para la discriminación entre proteínas.

SOLUBILIDAD. Las proteínas varían drásticamente en su solubilidad en diferentes

solventes. En unos pueden ser esencialmente insolubles y en otros solubles hasta
niveles de miles de miligramos por mililitro de solución. Las variables claves que
afectan la solubilidad de las proteínas incluyen el pH, fuerza iónica y polaridad de
solventes.
DENSIDAD. La densidad de la mayoría de las proteínas es aproximadamente 1.4
g/cm3 y generalmente no es usada como una propiedad para fraccionamiento de
proteínas. Sin embargo, las proteínas pueden contener fracciones de fosfatos o
fracciones de lípidos que las hacen más o menos densas, respectivamente. Esto
puede ser usado para que sean separadas del grueso de una mezcla de proteínas
utilizando métodos de gradientes de densidad.

HIDROFOBICIDAD. El número y la distribución espacial de residuos de aminoácidos

hidrofóbicos presentes en la superficie de las proteínas determinan la habilidad de
la proteína para enlazarse a otros materiales hidrofóbicos del empaque de una
columna cromatográfica, y por lo tanto su capacidad de fraccionamiento.

Afinidad. Muchas enzimas se unen a sustratos, efectores, cofactores, tripletes de

ADN y a ciertos iones metálicos como por ejemplo “Cu, Zn, Ca, Co” formando
enlaces muy fuertes. Estos enlaces pueden ser usados para ligar la enzima en una
columna en la que el ligando apropiado o los iones metálicos ha sido inmovilizado
(Burgess, 1987).

3. Métodos de fraccionamiento

PRECIPITACIÓN. El fraccionamiento basado en precipitación de la proteína puede

lograrse modificando: el pH, la fuerza iónica, las propiedades dieléctricas del
solvente, carga eléctrica y el tamaño.

pH. Aunque no es uno de los métodos que más se utilizan, la manipulación del pH
permite eliminar fácilmente algunos contaminantes. Una proteína es menos soluble
a pH isoeléctrico, que es el pH al cual la molécula no tiene carga 'neta. En estas
condiciones no hay repulsión electrostática entre moléculas de proteínas vecinas,
por lo que tienden a aglutinarse y a precipitar.

FUERZA IÓNICA. Las sales neutras influyen mucho en la solubilidad de las proteínas,
por lo que es uno de los métodos casi obligados en cualquier purificación proteica.
A concentraciones bajas, las sales aumentan la solubilidad de muchas proteínas.
Esto se debe a cambios en la tendencia de los radicales de los grupos aminos a
ionizarse en la proteína. A medida que la concentración de sales aumenta, la
solubilidad de la proteína disminuye y, cuando la fuerza iónica es suficientemente
alta se llega al punto en que la solubilidad de la enzima es igual a su concentración
y la proteína precipita en solución. El rango de concentración en el cual precipita
depende de: la naturaleza de la proteína, la naturaleza de la sal añadida, la
temperatura y el pH.
PROPIEDADES DIELÉCTRICAS DEL SOLVENTE. La adición de solventes orgánicos
neutros no miscibles con el agua, en especial el etanol y la acetona, disminuyen la
solubilidad en agua de la mayoría de las proteínas globulares.

CARGA ELÉCTRICA. En cada molécula de proteína hay un cierto número de grupos

que pueden disociar o unir protones, formando en el primer caso aniones y, en el
segundo caso, cationes. Debido a que cada proteína tiene una composición y
secuencia de sus aminoácidos distinta, tendrá propiedades ácido-base
características. Los métodos de separación y análisis de proteínas, en base a su
comportamiento ácido-base se pueden dividir en tres: cromatografía de intercambio
i6nico, electroforesis y adsorción.

TAMAÑO. Una característica de las proteínas es el gran tamaño de su molécula,

propiedad que se aprovecha en el diseño de métodos relativamente sencillos para
la separación de otras moléculas de tamaño pequeño. Entre estos métodos, los más
comunes son: diálisis y ultrafiltración, centrifugación y cromatografía de exclusión
molecular (Giral, l987).

ENZIMAS

Las enzimas son sustancias que se encuentran en las células en cantidades

pequeñísimas y participan al proceso de la vida. En cierta forma se puede
considerar a las enzimas como la parte activa de la célula. Como las enzimas son
proteínas o proteínas combinadas con otros grupos químicos, poseen las mismas
propiedades características: se desnaturalizan con el calor, precipitan con Etanol ó
concentraciones elevadas de sales inorgánicas como el Sulfato de Amonio y no
dializan a través de membranas semipermeables.

MÉTODOS PARA MEDIR PROTEÍNA Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

Antes de discutir la purificación de una enzima, es importante entender los

problemas involucrados en la determinación de la cantidad de proteína y actividad
enzimática en la muestra ya que estos datos son necesarios para la investigación y
para muchos otros propósitos tales como la determinación de pureza y evaluación
de rendimientos. (Burgess,1987).

En algunas aplicaciones de la investigación, el método de Bradford remplaza al

método de Lowry por las siguientes razones: el método Bradford es más fácil de
usar requiere de un reactivo y 5 min para hacer la determinación comparado con
tres reactivos y 30 a 40 min de la determinación de Lowry; la absorbancia del
complejo colorante-proteína es relativamente estable y no es afectada por muchos
de los compuestos que limitan la aplicación de la determinación de Lowry (Becker y
col., 1990).

1. Determinación de actividad enzimática

Para poder realizar un ensayo cuantitativo de la actividad enzimática es necesario

conocer lo siguiente:

a) La naturaleza de la reacción catalizada.

b) Cuáles son los cofactores y coenzimas necesarios.
c) Las concentraciones necesarias tanto para el sustrato como para el cofactor
o coenzima.
d) El pH óptimo requerido.
e) La temperatura óptima.
f) Un método analítico simple para determinar la desaparición del sustrato o la
aparición de productos de la reacción.

Para estudiar una enzima es necesario disponer de un método para determinar su

actividad catalítica. Los métodos están diseñados para medir la velocidad de
formación de producto o la velocidad de desaparición del sustrato, a menudo se
mide la cantidad de producto formado en un periodo de tiempo mediante una
determinación a tiempo fijo.

La forma en que se determina la cantidad de producto depende de sus propiedades

químicas y físicas. Si el producto es coloreado o puede sufrir una reacción para
producir un color, entonces puede medirse la absorbancia de la luz a una longitud
de onda adecuada (método colorimétrico), la cual se relaciona con la concentración
de producto presente en el momento de tomar la muestra. Los métodos
espectrofotométricos son muy útiles debido a que se puede seguir de forma
continua el progreso de la reacción mediante métodos cinéticos (Bradley, 1982).

OBTENCIÓN DE Β-GALACTOSIDASA

Existen varios métodos para la obtención de la enzima B-Galactosidasa en la Tabla

2 se presenta la comparación de tres métodos de purificación. Un método más
reciente que utiliza E. coli modificada genéticamente (Becker y col., 1990) ha sido
utilizado para integrar técnicas biotecnológicas.
 USOS DE LA ENZIMA β-GALACTOSIDASA

La β-Galactosidasa hidroliza a la lactosa en sus monosacáridos glucosa y

galactosa. Esta enzima se utiliza desde hace algunos años en la preparación de
productos deslactosados a base de leche o suero (Vassilis y López, 1985) Los
productos con lactosa hidrolizada presentan ventajas nutricionales, ya que
favorecen el consumo de lácteos por personas con intolerancia al disacárido
(Nijpels, 1981). Por otro lado, la Hidrolisis de la lactosa ofrece ventajas tecnológicas
debido a que la glucosa y galactosa son más dulces y solubles que la lactosa,
aunado a que ambos azúcares son más fácilmente fermentados (Brodsky y
Grootwassink, 1986). Al hidrolizar la lactosa se evitan problemas de cristalización
en helados, leches condensadas y productos que son elaborados con leche y suero
dulce de leche.
 CROMATOGRAFÍA

En un proceso de bioseparación, la purificación es el paso que sigue a la

concentración, puede realizarse con una amplia variedad de técnicas como la
cromatografía, la precipitación, ultrafiltración y electroforesis.

La cromatografía es comúnmente realizada en una columna empacada con

adsorbentes sólidos, sólidos porosos, o geles y al igual que la adsorción. Ambas
difieren en el objetivo y mecanismo de separación, mientras que en la adsorción la
meta es concentrar el soluto en un adsorbente para después eludirlo, en la elución
cromatográfica el objetivo es purificar el producto, esto se logra inyectando un pulso
de muestra en la columna, este pulso entra a la columna como un pico estrecho
(concentrado) y sale en forma dispersa (diluido) por la adición del solvente. A
diferencia de la adsorción que asocia, el análisis de su comportamiento a una curva
de ruptura, la cromatografía se asocia a un comportamiento Gaussiano.

En la cromatografía por elución los componentes de la muestra salen a diferentes

tiempos ya que son retardados de acuerdo con su afinidad por el adsórbete, que
puede ser de intercambio iónico, de afinidad o exclusión cromatográfica. La
diferencia en el tiempo de elución de los solutos de una mezcla inyectada a la
columna es el origen de la purificación (Belter y Col., 1988).

FUENTES DE CONSULTA

McCabe, W., Smith, J., & Harriot, P. (2007) Operaciones Unitarias en Ingeniería
Química. Séptima edición. Editorial: McGRAW-HILL. Pp (281-350)