Purificación de la Proteína 9 y 52 por el

Software Protein Purification

Cordova Merino, Aime1
Resumen deseada. De igual manera es necesario conocer y tener
En muchas aplicaciones experimentales es necesario sumamente controladas las condiciones de extracción
disponer de proteínas purificadas, incluyendo estudios de la proteína del medio donde se encuentra
estructurales y ensayos bioquímicos in vitro. Las (intracelular o extracelular), y una vez extraída
proteínas pueden ser obtenidas de tejidos o, más mantener en las condiciones adecuadas para
comúnmente, sobre expresándolas en algún organismo conservarla funcional y poder corroborar su
modelo como pueden ser las bacterias, las levaduras o purificación y rendimiento final del proceso
las células de mamífero en cultivo. La purificación de
proteínas implica aislarlas a partir de su fuente en base Metodología
a diferencias en sus propiedades físicas. El objetivo de La parte experimental de esta práctica se llevó a cabo
un esquema de purificación es retener la mayor mediante el uso del software Protein Purification
cantidad de proteína funcional con el menor número de desarrollado por la Facultad de Ciencias Biológicas de
contaminantes. El esquema de purificación de una la Universidad de Leeds; el cual se encuentra
proteína debe ser optimizado para completar el proceso disponible vía online en la dirección
en el menor número de pasos posible. Se utilizó un http://www.agbooth.com/pp_ajax/.
modelo simulador de purificación de proteínas, en el
cuál se aplicaron distintos métodos de separación para
a. Purificación de la proteína N°9
intentar purificar la proteína N°9 y N° 52.
Palabras claves: Purificación, Filtración por gel, Comienzo: Seleccionamos comienzo desde el
Cromatografía de Intercambio iónico, pH, Proteína. principio, nos dirigimos a la opción ensayar una mezcla
y elegimos complex mixture y le damos en purificar a
Introducción
la enzima 9
Las técnicas de separación y purificación de proteínas
son de gran importancia en los avances del área de las
ciencias biológicas y de la biotecnología, pues de esta
manera se puede conocer la función que éstas poseen
en las células (ya sea estructurales, enzimáticas, de
transporte, entre otras). Las técnicas de purificación se
basan en las propiedades físicas y químicas de estas
moléculas, e implican la separación de una proteína de
una mezcla de moléculas con características similares
donde la proteína de interés constituye una mínima
fracción. Figura 1. Complex mixture
Por esto, es necesario aprovechar las características que Separación: Seleccionamos el método Filtración en
diferencian a unas proteínas de otras, como pueden ser gel, nos dirigimos a medios de filtración en gel,
su tamaño y forma, masa molar, carga neta, punto escogemos la opción Ultrogel ACA 54
isoeléctrico, hidrofobicidad, su interacción con iones
metálicos, solubilidad, termo resistencia, entre otras.
Las técnicas que sirven para separar y purificar
proteínas pueden ser de precipitación, adsorción,
electroforéticas, y cromatografías; cada una de estas
tiene sus variantes, que se basan y se eligen
dependiendo de las propiedades de la proteína que se
desee purificar. Para las técnicas de precipitación
existen agentes precipitantes que pueden ser cationes y
aniones; las técnicas cromatografías se efectúan con
filtración en gel, columnas de intercambio iónico,
columnas de interacción hidrofóbica o covalentes, entre
otras; para la electroforesis se encuentra de una Figura 2. Medios de Filtración en gel
dimensión (basada en el tamaño molecular de la Fracciones: Escogemos la opción ensayar la actividad
proteína) o de dos dimensiones (basada en tamaño enzimática y seleccionamos combinar fracciones y
molecular y punto isoeléctrico de la proteína en tabulamos un rango que se encuentre dentro de la
cuestión). Actualmente se cuenta con un gran número actividad enzimática y le damos en verificar y aparece
de técnicas de separación y purificación de estas el comportamiento de la actividad enzimática.
moléculas de suma importancia biológica, pero el
problema real y limitante reside en conocer qué técnica
utilizar en base a las propiedades de la proteína
 Figura 6. Representación de la proteína 9 a purificar

Después de utilizar diferentes métodos de separación

nos damos cuenta que con el método filtración en gel
tenemos como resultado de la purificación menor
cantidad de proteínas en solución y continuamos con
Figura 3. Combinar fracción los siguientes métodos sucesivamente.

Figura 7. Purificación de la proteína 9 de Complex Mixture

b. Purificación de la proteína N°52

Comienzo: Seleccionamos comienzo desde el

principio, nos dirigimos a la opción ensayar una mezcla
Figura 4. Ensayo de la calidad Enzimática y elegimos complex mixture y le damos en purificar a
Page: Seleccionamos la opción Page en 2 dimensiones la enzima 52.
y aparecerá un diagrama con las proteínas separadas.
Luego escogemos la opción Page Wester Blot donde
observamos la representación de cómo debería quedar
purificada nuestra enzima 9.

Figura 8. Complex mixture

Separación: Seleccionamos el método “Cromatografía
de Intercambio Iónico”, nos dirigimos a medios de
intercambio iónico, escogemos la opción Q-Sepharose
y luego Gradiente sal

Figura 5. Proteínas purificadas

Figura 9. Medios de intercambio iónico

Digitamos un pH buffer y especificamos los limites de
gradiente molar.
 Figura 10. Equilibracion
Figura 11. Límites de gradiente molar
Fracciones: Escogemos la opción ensayar la actividad
enzimática y seleccionamos combinar fracciones y
tabulamos un rango que se encuentre dentro de la
actividad enzimática y le damos en verificar y aparece
el comportamiento de la actividad enzimática.
Figura 12. Combinar Fracciones
Figura 13. Ensayo de la calidad Enzimática
Page: Seleccionamos la opción Page en 2 dimensiones
y aparecerá un diagrama con las proteínas separadas.
Luego escogemos la opción Page Wester Blot donde
observamos la representación de cómo debería quedar
purificada nuestra enzima 52.
Figura 14. Proteínas purificadas
Figura 15. Representación de la proteína 52 a purificar
Después de utilizar diferentes métodos de separación
nos damos cuenta que con el método Cromatografía de
Intercambio Iónico tenemos como resultado de la
purificación menor cantidad de proteínas en solución y
continuamos con los siguientes métodos
sucesivamente.
Figura 16. Purificación de la proteína 52 de Complex Mixture
Resultados
a. Purificación de la proteína 9
Después de haber efectuado 10 corridas de purificación
por diversos métodos nos damos cuenta que métodos o
que pasos son útiles o inútiles para nuestra
purificación.
Tabla 1 Filtración por Gel
Tabla 2 Cromatografía de Intercambio Iónico
Tabla 3 Tratamiento con calor

Figura 17. Purificación de la proteína 9 de Complex Mixture por
tres métodos de purificación
Figura 18. Proteína 9 a purificar
Figura 19. Proteína 9 purificada
b. Purificación de la proteína 52
Luego de haber efectuado 10 corridas nos damos
cuenta que métodos o que pasos son útiles o inútiles
para nuestra purificación.
Tabla 4 Cromatografía de Intercambio Iónico
Tabla 5 Cromatografía de Interacción hidrofóbica
Tabla 6 Tratamiento con calor
Figura 20. Purificación de la proteína 52 de Complex Mixture por
tres métodos de purificación
Figura 21. Proteína 52 a purificar
Figura 22. Proteína 52 purificada
Discusión
Las proteínas se purifican mediante procedimientos de
fraccionamiento. En una serie de etapas
independientes, se aprovechan las diversas propiedades
fisicoquímicas de las proteínas que interesan para
separarlas progresivamente de otras proteínas y/o de las
demás sustancias. Las características de las proteínas
que se emplean en los diversos procedimientos de
separación son: solubilidad, carga iónica, tamaño
molecular, propiedades de absorción y capacidad de
unión a otras moléculas biológicas (Voet, 1992).
Para la purificación de la proteína 9 se usó la técnica
de filtración en gel debido a que unos amplios rangos
de moléculas biológicas pueden ser separadas en base a
diferencias en tamaño y forma, estas características
afectan su habilidad de penetrar matrices porosas. Se
puede emplear una variedad de matrices porosas, adecuados para su separación y purificación de
dependiendo de la naturaleza de las moléculas a una mezcla proteica o fisiológica con los mayores
separar, sabiendo esto y con los resultados del PAGE rendimientos posibles.
de dos dimensiones se determinó que la columna que  Los métodos de aislamiento se deben escoger de
podría separar la mayor parte de impurezas de la tal manera que la proteína no se desnaturalice ni
mezcla es la de Ultrogel AcA 54 ya que su rango de se afecte su composición química, ya que, al
fraccionamiento aproximado de separación es de 109 - buscar una proteína de interés, se busca obtener
120, con dicha técnica se lograron eliminar muchas de grandes cantidades de ella para su posterior
las proteínas que se tenían de impurezas quedando 8 estudio enzimático, por ejemplo.
proteínas. Posteriormente se utilizó la técnica de
cromatografía de intercambio iónico tomando en Referencias
cuenta los valores de pH en los que la proteína de  García Pérez, Hilda Marilin. “Electroforesis en
interés se encuentra estable con un rango de geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e
fraccionamiento de 109 – 120 observando los importancia”. UNIV DIAG 2000; 1 (2): 31-41.
resultados en PAGE de dos dimensiones quedando 4  Janson, Jan-Christer. “Protein Purification:
proteínas por purificar. Por último, la técnica realizada Principles, High Resolution Methods, and
fue el tratamiento con calor, pues se nos mencionó que Applications”. 3a Edición. Vol. 54. Editorial Wiley.
la proteína soportaba temperaturas altas de hasta 50°C EUA, 2011. Págs. 4-10
por 90 minutos dando los resultados en PAGE 1  Sheehan, D., O’Sullivan, S. Ion Exchange
proteína quedando la proteína 9 purificada. Chromatography. Encyclopedia of life sciences.
Para la purificación de la proteína 52 se utilizó el John Wiley & Sons Ldt, 2001. Págs. 1-4.
método de intercambio iónico. El fundamento de esta  Voet, Donald; et. al. “Fundamentos de Bioquímica.
técnica son las interacciones electrostáticas entre las La vida a nivel molecular”. 2ª Edición.
proteínas de la muestra y los grupos cargados de la Editorial Médica Panamericana. España, 2009.
columna. Para esto, los aniones de las proteínas se unen Págs. 98, 101-103, 105-107.
a los grupos catiónicos intercambiadores de aniones de  Software utilizado disponible en:
columna, o viceversa, los cationes se unen a los grupos http://www.agbooth.com/pp_ajax/
aniónicos intercambiadores de cationes de la columna.
Para poder conocer qué columna utilizar es necesario
conocer el punto isoeléctrico de la proteína para saber a
qué pH trabajar en la columna y de esta manera
predecir si la proteína se encontrará carga positiva o
negativamente, y así, si la columna a utilizar será
intercambiadora de aniones o cationes, se utilizó un pH
buffer de 8.5 con una fracción 109 - 120 quedando
como resultado en PAGE 9 proteínas por purificar. La
siguiente Técnica de separación que se utilizo fue la
interacción Hidrofóbica con el método de elución
Octyl-Sheparose CL 4B con una fracción de 44 – 54
quedando como resultado en PAGE 4 proteínas por
purificar. Para finalizar tratamiento con calor, pues se
nos mencionó que la proteína soportaba temperaturas
hasta 40°C por 45 minutos dando en PAGE como
resultado 1 proteína, de tal manera quedando la
proteína 52 purificada. Como la estabilidad térmica de
las proteínas es variable (según su función y su sitio de
acción) se aprovechó su termo estabilidad ya que las
proteínas termo sensibles se desnaturalizan perdiendo
su estructura funcional facilitando así la purificación de
la proteína de interés. Esta técnica es útil para las
proteínas termoestables ya que permite su separación
de proteínas termolábiles.

Conclusiones
 Las propiedades físicas y químicas propias de una
enzima son de vital importancia, ya que a partir
de éstas se seleccionarán los métodos más