Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Química. Departamento de Bioquímica

Laboratorio de Bioquímica Experimental)

“Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de

pollo”

Equipo 5.Integrantes: Vázquez Pérez Miguel Ángel

RESUMEN: desarrolló un método experimental

No existe un procedimiento único para que va desde la obtención de la
la purificación de una enzima, esto enzima a partir de músculo
depende del uso final que se le dará a esquelético de pollo, hasta su
la proteína de interés y de las purificación y revisión de la actividad
propiedades que pueda tener para enzimatica que presenta para valorar
aprovecharlas en cada paso de qué tan eficaz fue nuestro proceso de
purificación. purificación.

Generalmente se procede a purificar Utilizando técnicas como precipitación

una enzima para poder precisar su por salado, cromatografía de
secuencia de aminoácidos, investigar intercambio iónico
su función bioquímica, para un uso
posterior en aplicaciones terapéuticas
o biotecnológicas o para establecer
relaciones evolutivas.

La enzima lactato deshidrogenasa

(LDH) es una proteína constituida por
cinco uso enzimas diferentes que
canalizan la interconversión de L-
lactato y piruvato. La LDH está
presente en el citoplasma de todos los
tejidos humanos con las
concentraciones más elevadas en el
hígado, el corazón y el músculo
esquelético, y más bajos en los
eritrocitos, el páncreas, riñón y INTRODUCCIÓN
estómago. En muchas aplicaciones
experimentales es necesario disponer
A partir de las diferentes propiedades de proteínas purificadas, incluyendo
físico-químicas que presenta la LDH, estudios estructurales y ensayos
como su peso molecular, punto bioquímicos in vitro. Las proteínas
isoeléctrico, solubilidad, estabilidad y pueden ser obtenidas de tejidos o, más
unión específica a ligandos se comúnmente, sobre expresándose en
algún organismo modelo como pueden
ser las bacterias, las levaduras o las
células de mamífero en cultivo. La
purificación de proteínas implica
aislarlas a partir de su fuente en base a
diferencias en sus propiedades físico-
químicas. El objetivo de un esquema de
purificación es retener la mayor
cantidad de proteína de interés activa
con el menor número de
contaminantes.
La consideración más importante en el
desarrollo de un esquema para
purificar una proteína son las
aplicaciones que se pretenden dar a
esa proteína. Tanto la cantidad como
la calidad de la proteína deben ser
suficientes para el análisis
experimental. Además, se debe tener
en cuenta información acerca del
comportamiento de la proteína, ya que
se requiere del correcto plegamiento
de la proteína para poder estudiarla.
Durante la purificación, y subsiguiente
almacenamiento de la proteína,
pueden ocurrir muchos procesos que
afecten su calidad: desnaturalización,
agregación, degradación y pérdida de
función. Un planeamiento cuidadoso
que permita purificar la proteína tan
rápido como sea posible y bajo las
condiciones que más promueven la
estabilidad de la proteína maximizará
las posibilidades de realizar una
purificación exitosa.
La bioquímica dio un gran paso
adelante con el desarrollo de la
centrifugación como método para
separar y aislar estructuras
subcelulares y macromoléculas en base
a su tamaño, forma, y/o densidad,
proceso denominado fraccionamiento
subcelular. Las técnicas de
centrifugación usadas para este
objetivo incluyen la centrifugación
diferencial y la centrifugación en
gradiente de densidad, que separan
orgánulos y otras estructuras
subcelulares en base a diferencias en
tamaño y/o densidad, y la
centrifugación en equilibrio de
densidad, es una técnica poderosa para
separar orgánulos y macromoléculas en
base a las diferencias de densidad.
Otras técnicas biológicas que han sido
muy útiles para aislar y purificar
componentes subcelulares incluyen la
cromatografía y la electroforesis.
Cromatografía es un término general
que incluye una variedad de técnicas en
las que se fracciona progresivamente
una mezcla de moléculas mientras la
solución fluye a través de una fase
inmóvil y absorbente, contenida
generalmente en una columna. Las
técnicas cromatográficas separan
moléculas en base al tamaño, la carga o
la afinidad por moléculas o grupos
funcionales específicos.
Por otro lado. la electroforesis hace
referencia a diversas técnicas
relacionadas que utilizan un campo
eléctrico para separar moléculas en
base a su movilidad. El ritmo al que
cualquier molécula se mueve durante la
electroforesis depende de su carga y de
su tamaño. El medio más común para la
separación electroforética de proteínas y
ácidos nucleicos es un gel de agarosa o
de poliacrilamida.
Los ensayos de actividad permiten
evaluar la pureza y el rendimiento de
una enzima, así como su actividad
cinética. Esta se determina midiendo la
cantidad de sustrato que desaparece o
bien de producto que se forma por
unidad de tiempo.
La LDH es una enzima que se clasifica
como óxido-reductasa por catalizar una sustrato. La concentración de producto
reacción redox. Participa en el no cambia con respecto al tiempo.
metabolismo anaerobio de la glucosa, la
reacción que cataliza es la conversión HIPÓTESIS
reversible de lactato a piruvato en las Se realizará la purificación de una
células cuando la tensión de oxígeno es enzima como la lactato
baja y la demanda de ATP es alta. deshidrogenasa que se obtendrá del
En la reacción se pierden dos electrones músculo esquelético de pollo por
del NADH, el cual funge como coenzima medio de métodos como la
de la reacción, oxidándose a NAD+, es precipitación por salado y
justo esta reacción en la cual se basa el cromatografía de intercambio iónico
ensayo de actividad de la LDH, pues se esperando tener una obtención de
detecta el cambio de absorción del concentraciones cuantificables
NADH y el NAD+. tomando en cuenta que el nivel de
El NADH es una molécula que absorbe pureza dependerá de la buena
a 340 nm mientras que el NAD+ no aplicación de los métodos .
absorbe a esa longitud. Por tanto la
actividad de la enzima se detecta como OBJETIVO GENERAL
una disminución en la absorción a 340
nm, pues el NADH va desapareciendo Basándonos en propiedades
debido a su conversión a la forma fisicoquímicas de la proteína Lactato
oxidada. Deshidrogenasa (LDH) de músculo de
Cuando se realizan ensayos temporales pollo como carga , punto isoeléctrico,y
se obtienen gráficos que presentan por afinidad, podemos relacionarlas y
lo general tres fases. La primera fase utilizar diferentes técnicas para
ocurre generalmente durante el primer purificar la proteína estudiada.
segundo, en esta fase denominada
transitoria suelen ocurrir las reacciones OBJETIVO
de formación del o los intermediarios de
vida corta, y se puede evaluar el número ● Obtener la mayor cantidad de
de pasos que limitan la velocidad de la proteína funcional con el menor
enzima, en la fase dos en la segunda número de contaminantes, en el
fase, la concentración de producto se menor número de pasos
incrementa linealmente conforme el posible, aprovechando sus
tiempo transcurre. La velocidad inicial de propiedades físico químicas.
una reacción ocurre en los primeros ● Determinar el peso molecular
minutos de la reacción, una relación de la proteína purificada.
lineal que se mantiene cuando el
consumo de sustrato no va más allá del METODOLOGÍA
5% de la concentración inicial, Se llevó a cabo la metodología
finalmente en la fase 3 se produce por descrita en : Sánchez Nieto, Dra.
cambios que generalmente se deben al Sobeida.“Manual de prácticas de
decremento en la concentración de Bioquímica experimental (0141)”
Facultad de Química. Departamento
de Bioquímica 2013. Editora: Dra. Homogeneizado F1 16.5
Nahieli Greaves Fernández.pp 9- Precipitación
F2 17.0
11,14-,17,19-21. 55% (NH4)2SO4

Precipitación
F3 2.2
RESULTADOS 75% (NH4)2SO4

Parte 1 . Extracción y precipitación Filtración en gel F4 0.1

por salado
Cromatografía Fracción
1.0
Se obtuvo la fracción 0 de afinidad A, B Y C

Se obtuvo la fracción 1
( Homogeneizado total) Tabla 2 Concentración de proteína calculada por la
absorbancia a 280nm
Precipitación con (NH4)2SO4
Tubo Abs. Conc.
FRACCIÓN 3 (mcg/mcL)
Parte 2 . Purificación por F1 0.385 0.583
cromatografía y de afinidad
F2 0.133 0.201
Desalado mediante cromatografía de
exclusión molecular (Fracción 4 ) F3 0.560 0.848

Purificación por cromatografía de a F4 0.069 0.104

afinidad .
FPA -0.194 -0.294
Se trabajó con la fracción f3 obtenida
FPB 0.007 0.010
de prácticas anteriores
Parte 3 . Determinación de la FPC 0.566 0.086
concentración de proteínas
Determinación por el método de
Tabla .3 Determinación de la concentración de proteína de
absorbancia a 280nm. las fracciones obtenidas durante los diferentes pasos de la
Tabla 1:Métodos de purificación y fracciones purificación de la LDH de músculo esquelético de pollo.
obtenidas para la enzima LDH
Métodos Fracciones Fracción Dilución Volúmen ensayo Branford Abs
(mcL)+ H2O(mcL) (mcL)

Rotura de membranas F0
F1 1:100 40+760 200 0.745
y posterior filtración
F2 1:50 40+760 200 0.811
Centrifugación F1
(Sobrenadante)
F3 1:100 10+790 200 0.476
Precipitación con 55% F2
(NH4)2SO4 F4 1:100 20+780 200 0.480

Precipitación con 75% F3 FPA SD 10+790 200 0.530

(NH4)2SO4
FPB SD 10+790 200 0.559
Cromatografía de F4
exclusión molecular FPC SD 10+790 200 0.479

Cromatografía de FP
afinidad Tabla .4 Contenido de proteína a 595nm

Tubo Vol .de Abs. Contenido

ensayo de proteína
Tabla 1.2 Volúmen de cada fracción obtenida.
(mcL) (mcg/mcL)

Fracción Volumen F1 40 0.745 19.03

Proceso
obtenida fracción (mL)
F2 40 0.811 10.36
Inicio F0 ---
F3 10 0.476 48.39
 F4 20 0.480 24.40

FPA 10 0.530 0.5396

FPB 10 0.559 0.5695

FPC 10 0.479 0.4870

Tabla 3. Concentración de proteína en cada una de las

fracciones del proceso de purificación.

Fracción Proteína enl Volumen Concentración Rf =(Distancia que migra la proteína)/(Distancia que migr
la fracción total de la de cada Rf=(1.6 cm)/(4.4 cm )=0.36
(mg) fracción(m fracción
L) (mg/mL)
Para calcular el PM de nuestras fracciones :
F1 304.48 16.5 19.03 Log Rf= -1.1121x-1.8734
PM= antilog[-1.1121(0.36)+1.8734]
F2 176.12 17.0 10.36 PM= 29.71
para finalmente extrapolar conociendo el peso
F3 106.46 2.2 48.34
molecular de la LDH de nuestras fracciones.
F4 2.44 0.1 24.40 El resultado obtenido fue de 29.71 kDa
para nuestras fracciones purificadas..
FA 0.5396 1.0 0.5396

FB 0..5695 1.0 0.5694 𝐺𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑝𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎=( 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎

𝐹(𝑛))/( Actividad enzimática específica F1)
FC 0.4870 1.0 0.4870 Rendimiento=( 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝐹(𝑛))/( Actividad
Total F1)×100

SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN GEL DE Ejm. (F 1) 0.2543 mmol/min.ml /0.138

POLIACRILAM,INA -SDS
mmol⇒1.84mmol/min

Rendimiento.4.195mmol/min / 4.195 mmol/min

x100⇒100%

Gráfica 2

Figura 1. Se muestra el proceso de la

purificación de la LDH de músculo de pollo,
partiendo de la F1 hasta las fracciones
purificadas A,B, y C. Las muestras fueron
teñidas con azul de Coomassie.

Con nuestras proteínas separadas se

midieron las distancias que cada una
recorrido y mediante el peso molecular, se
graficó el log de los pesos moleculares de las
proteínas en función de los Rf utilizando la
ecuación de la recta para calcular el PM de
nuestras muestras Tabla 4. Regresión lineal con los datos
obtenidos.
Gráfica 1 Fracción Pendiente obtenida
 F1 y = -0.6143x + 1.2674 centrifugación a 7000 RPM(basada en
R² = 0.9916
peso molecular de componentes que
F2 y = -0.1237x + 0.4741 se sedimentaran ) a 4`C durante 10
R² = 0.9998
minutos del homogeneizado con el fin
de clarificar la muestra (fracción 1)
F3 y = 0.0014x + 0.123
R² = 0.0088 Después se llevó a cabo la
F4 y = -0.222x + 1.0985
precipitación selectiva de proteínas
R² = 0.9845 por adición de sulfato de amonio, esta
FA y = -0.3065x + 0.4521 técnica se basa en modificar el
R² = 0.9776
ambiente que rodea la proteína
implicada para que de esta manera
FB y = -0.2953x + 0.5745
R² = 0.8986 precipite en el proceso llamado
“salting out” el cual lleva a cabo un
FC y = -0.2967x + 0.5727 mecanismo en donde la sal establece
R² = 0.9161
puentes de hidrógeno con el agua y al
TABLA 5. Actividad enzimática, total y
hacerlo sustrae el agua de la proteína
específica. ,modificando la conformación de esta
para que no haya exposición de los
Fracción Actividad Actividad Actividad residuos apolares con el
enzimática Total Específica
(mmol/min.m
solvente,formando nuevas
(mmol/min. (mmol/mi
mL) n) g) interacciones que dan lugar a la
formación de plegamientos que llevan
F1 0.2543 4.195 0.0138
a la precipitación y de igual forma a la
F2 0.02560 0.4352 0.00247 eliminación de contaminantes de una
F3 0.00225 0.00495 0.00004652
forma económica.
La precipitación de proteína depende
F4 0.1802 0.01802 0.00738 de sus características iónicas y del
FA 0.004927 0.004927 0.009131 contenido de residuos polares que
tenga.,para precipitar la proteína
FB 0.004747 0.004747 0.00833
Lactato Deshidrogenasa , se utilizó
FC 0.00477 0.0477 0.00979 una saturación del 55% de
( NH4)2SO4 (fracción 2) y en una
DISCUSIÓN segunda secuencia de precipitación se
utilizó una solución al 75%de
En la primera parte de Extracción y saturación de ( NH4)2SO4 con el fin
precipitación por salado , se llevó a de obtener la mayor cantidad de
cabo una homogeneización , que es proteína pura (fracción 3).
un proceso en donde las células o En la tabla 1 se indican los métodos
tejido se lisan en fragmentos de purificación y fracciones obtenidas
pequeños que dan lugar a una para la enzima LDH , en la tabla 1.2 se
suspensión uniforme y estable llamada indican los Volúmenes obtenidos de
homogeneizado , este procedimiento cada fracción .
se llevó hizo en una licuadora , Una vez obtenidas las fracciones se
posteriormente se llevó a cabo una retiró el agente precipitante , en este
caso la sal de sulfato de amonio .,esto
se hizo por medio de una
cromatografía de exclusión molecular
en donde se utilizó una columna de
Sephadex G-25 tamaño de poro
pequeño ,entonces la sal se queda en
la columna y la proteína sale por
gravedad ya que esta técnica de
desalado se basa en la masa, también
se utilizó un amortiguador que
contiene un buffer de TRIS/HCl pH 8.6
(20 mM), el cual equilibra el pH en la
solución , B-mercaptoetanol (0.5mM)
el cual rompe puentes disulfuro de
proteínas ,inhibiendo la oxidación de
estas ,lo que es importante para
obtener la proteína intacta. o de
afinidad la cual está basada en el
peso molecular de la proteína y
PMSF(1 mM) que es un inhibidor de
proteasas, proteínas que interfieren en
la purificación de la deshidrogenasa
(fracción 4)
Posteriormente se llevó a cabo una
cromatografía de afinidad ,esto con el
fin de obtener una proteína pura o con
la menor cantidad de contaminantes.,
este método se basa en la afinidad
que tiene la proteína por un ligando en
este caso el azul cibacron al tener una
estructura similar al NADH, la LDH se
une (ligando-resina) ,en una unión
Covalente, así cuando la muestra
atraviesa la columna de afinidad la
proteína se unirá al ligando, la fracción
no absorbida se desechó ya que no
contiene proteína y la LDH se
despega de la columna con
amortiguador de elución. (fracciones
A,B,C).
En la tabla 2 se muestra la
concentración de proteínas basada en
el método absorbancia a 280nm.
Para monitorear nuestra purificación
utilizamos el método de Bradford, en
el cual leímos las absorbancias a 595
nm de todas las fracciones del
proceso de purificación. Se obtuvo la
curva patrón y con la ecuación de la
recta se obtuvo el contenido de
proteína y la concentración de
proteína. Los resultados de la curva
patrón se muestran en la gráfica 1.
Finalmente se llevó a cabo el método
de separación de proteínas utilizando
gel de poliacrilamida-SDS, se
determinó que la reacción obtenida
tiene un peso molecular de 29.71 kDa
para nuestras fracciones purificadas al
comparar este resultado con el
reportado en la literatura (35 kDa)
nos damos cuenta que el PM obtenido
fue bajo ; esto puede deberse a que
fue la primera vez que se trabajó con
un gel de este tipo
CONCLUSIÓN
La parte esencial para poder llevar a
cabo la purificación de la proteína son
las propiedades fisicoquímicas (la
solubilidad, la carga iónica, el tamaño
molecular y la especificidad de unión a
otras biomoléculas) ya que
dependiendo de éstas se llevan a
cabo la separación con los distintos
métodos de purificación. Conociendo
los fundamentos de cada método se
pueden optimizar los resultados
sabiendo que es lo que puede
favorecer o no la purificación de una
proteína en particular.
La actividad total de una enzima está
relacionada con el rendimiento del
proceso de purificación, conforme se
avanza en el proceso, el rendimiento
va disminuyendo, el cual se ve
reflejado en una disminución de la
actividad total de la enzima. De forma
simultánea, el grado de pureza está
relacionada con la actividad
específica, un alto grado de pureza se
ve reflejado en una alta actividad
enzimática.
Los resultados obtenidos se vieron
afectados debido a que las muestras
deben mantenerse a 4°C para evitar la
desnaturalización enzimática y nuestro
caso hubo ocasiones en donde esto
no se llevó a cabo .
BIBL
LEHNINGER.Albert L. “Principios de
Bioquímica” Ediciones Omega S.A. 2a. edición
1993. pp 400-416.
LOZANO.Teruel.J.A. “Bioquímica para ciencias
de la salud” Editorial: Interamericana Mc Graw
Hill. ej 2 1998. PP.239-244.
Sánchez Nieto, Dra. Sobeida.“Manual de prácticas
de Bioquímica experimental (0141)” Facultad de
Química. Departamento de Bioquímica 2013.
Editora: Dra. Nahieli Greaves Fernández.pp 9-
11,14-,17,19-21.
Resumen
Desde hace décadas se ha estudiado
el metabolismo celular;como la
energía química almacenada en la
glucosa y otras moléculas
combustibles se libera para realizar
trabajo biológico en los organismos.
Uno de los procesos más estudiados
es la glucólisis en donde al degradarse
una molécula de glucosa en una serie
de reacciones catalizadas
enzimáticamente nos da formación a
Piruvato ( compuesto de alta
energía ) . Cuando en los tejidos
animales no hay oxígeno suficiente
para mantener la oxidación aeróbica
del piruvato y del 10 NADH(moléculas
con alta energía) producidos en la
glucólisis , el NAD+ se regenera a
partir del NADH mediante la reducción
del piruvato a lactato , reacción
catalizada por la lactato
deshidrogenasa .El lactato formado
por los músculos activos en los
vertebrados se transporta por la
sangre al hígado en donde se
convierte en glucosa durante la
recuperación después de la actividad
física rigurosa.La purificación de la
enzima lactato deshidrogenasa se
llevó a cabo en cuatro partes. La
primera se llevó a cabo la purificación
de la enzima lactato deshidrogenasa
(LDH) la cual se extrajo a partir de
pechuga de pollo, mediante un
proceso de homogeneización y
posteriormente por una centrifugación
diferencial. Para llevar a cabo la
purificación se utilizaron métodos
como precipitación por salado con
sulfato de amonio al 75 %,
cromatografía de exclusión molecular,
cromatografías de afinidad e
intercambio iónico (dependiendo el
equipo) y finalmente una electroforesis
en gel. Se fueron determinando a lo
largo del proceso la concentración de
proteínas que se obtenían en las
fracciones recolectadas utilizando el
método colorimétrico de Bradford.
Para esto lo primero que se necesitó
fue conocer la estructura y
propiedades fisicoquímicas de las
proteínas ya que es fundamental para
aplicar las técnicas de purificación
.Para la segunda parte se realizó un
desalado de la muestra mediante
filtración en gel lo que posteriormente
nos llevó a una purificación mediante
una columna de intercambio iónico.
Continuando con la tercera parte se
evaluó el rendimiento a partir de la
determinación de la cantidad total de
proteína llevándonos , finalmente a la
cuarta parte en donde se determinó la
pureza al realizar la separación de las
muestras proteicas y su visualización
en un gel de poliacrilamida-SDS. En
esta práctica se realizó la
comprobación de la purificaciòn de la
proteína de interés, utilizando la
cuantificaciòn de la actividad
enzimática, este es uno de los
métodos más utilizados para identificar
una proteína, nos permite también
determinar los parámetros cinéticos
Palabras clave : Enzima LDH,
precipitación, centrifugación,
cromatografía, electroforesis,
purificación proteína cinetica
enzimatica, sustrato, actividad