Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Resumen
Todas las células contienen miles de proteínas que difieren en tamaño, forma y
carga; cada una con una función, por esto su estudio es de suma importancia, pues
gracias a este es posible conocer mejor la naturaleza de fenómenos de interés en
los seres vivos. Para estudiar su actividad esta debe estar lo más purificada posible,
así como su aplicación en la biotecnología, biomédica, entre otras. Para purificarla
se deben tomar en cuenta sus propiedades y así seleccionar un método o más. Con
un programa de simulación de purificación de proteínas y aplicando los
conocimientos teóricos es posible separar una proteína de una mezcla compleja de
proteínas. En este trabajo, se elaboró un protocolo de purificación utilizando el
programa Agbooth para separar la proteína 5 de una mezcla compleja de 60
proteínas obteniendo 14.2 mg de proteína, 71.0 % de rendimiento y un costo de
1,783 h/100U.
Palabras clave: Purificación de proteínas, simulador Agbooth, precipitación por
salada, cromatografía, filtración en gel.
Abstract
All cells contain thousands of proteins that differ in size, shape, and charge; each
one with a function, for this reason its study is of the utmost importance, because
thanks to this it is possible to better understand the nature of phenomena of interest
in living beings. To study its activity, it must be as purified as possible, as well as its
application in biotechnology, biomedicine, among others. To purify it, its properties
must be taken into account and thus select one or more methods. With a protein
purification simulation program and applying theoretical knowledge it is possible to
separate a protein from a complex mixture of proteins. In this work, a purification
protocol was developed using the Agbooth program to separate protein 5 from a
complex mixture of 60 proteins, obtaining 14.2 mg of protein, 71.0% yield and a cost
of 1,783 h/100U.
Keywords: Protein purification, Agbooth simulator, salt precipitation,
chromatography, gel filtration.
Introducción
Las proteínas desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las
biomoléculas más versátiles y más diversas. Realizan una enorme cantidad de
funciones diferentes, entre ellas funciones estructurales, enzimáticas,
transportadoras.
El conjunto de técnicas para purificar moléculas de naturaleza proteica se ha
convertido en un campo de estudio amplio. Contar con una proteína pura permite,
de manera directa y específica, la caracterización de su función, estructura,
estabilidad, la interacción con otras biomoléculas, con la finalidad de comprender los
procesos moleculares y celulares. Asimismo, se explora la posibilidad de su
aplicación en la biotecnología, biomedicina, nanotecnología, entre otras áreas.
Las técnicas para purificar una proteína se determinan a partir de una o varias de
estas propiedades, como son la carga, el peso molecular, la hidrofobicidad, la
especificidad por algún ligando, principalmente [1].
Debido a que cada proteína tiene características únicas, no hay un procedimiento
único para la purificación de proteínas, aunque sí es posible desarrollar un protocolo
de separación eficiente teniendo en cuenta los aspectos antes mencionados.
Algunos de los métodos más empleados para la purificación proteica son:
● Precipitación con (NH4)2SO4. Uno de los métodos más utilizados para
eliminar proteínas contaminantes. Mediante su uso, es posible eliminar
contaminantes como otras proteínas, ácidos nucleicos y virus.
● Filtración en gel. Permite el paso selectivo de moléculas con masa molecular
definida.
● Cromatografía de intercambio iónico. Es una técnica que separa las
biomoléculas de acuerdo a su carga. Los grupos cargados sobre la superficie
de una proteína interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase
estacionaria.
Objetivos
Objetivos generales
● Relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de
las técnicas utilizadas en la purificación de proteínas.
● Diseñar un protocolo que contenga los pasos necesarios para purificar una
proteína.
Objetivos particulares
● Purificar una proteína contenida en una mezcla compleja mediante el simulador de
purificación de proteínas Agbooth.
● Aplicar el conocimiento teórico de precipitación por salado, cromatografía en
filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y electroforesis para purificar la
proteína de interés.
Hipótesis
Si se comprende la relación existente entre las propiedades fisicoquímicas de las
proteínas y las técnicas de purificación, entonces se podrá diseñar un protocolo
adecuado para purificar una proteína manteniendo así tanto la actividad enzimática
como el rendimiento de la misma.
Procedimiento
1. Se seleccionó la proteína 5 de una mezcla compleja de 60 proteínas en el
simulador Agbooth, el cual proporcionó la siguiente información: la actividad
enzimática de la proteína 5 es estable por varias horas a una temperatura de
hasta 50°C y a valores de pH entre 3 y 11.
2. Se realizó una electroforesis SDS-PAGE de la mezcla.
3. Después se realizó una precipitación con sulfato de amonio con una
saturación de 80 %. Se indicó al programa usar el precipitado, de este último
se realizó una electroforesis SDS-PAGE.
4. Posteriormente se hizo un tratamiento con calor a 38ºC por 1 hora, así como
una tercera electroforesis SDS-PAGE.
5. A continuación se realizó una filtración en gel con Sephadex G-100. A través
de un ensayo de actividad se estableció que fracción utilizar y se realizó
nuevamente una electroforesis SDS-PAGE.
6. Se realizó una cromatografía de intercambio iónico con DEAE-cellulose a un
pH de 7.0 (método de elución: gradiente pH) iniciando con un gradiente de
6.5 y finalizando en 7.5. Se determinó que fracción utilizar con un ensayo de
actividad y se realizó una electroforesis SDS-PAGE más.
7. Finalmente, se empleó una cromatografía de afinidad con MC05A y se eluye
con Tris/HCl 2 mM, pH 7.4. Por medio de un ensayo de actividad se
seleccionó la fracción a utilizar, por último, se efectuó una electroforesis
SDS-PAGE.
Resultados
Se inició con 959.0 mg de proteínas, una actividad total de enzima de 6000.0 U y un
rendimiento de 100%.
Luego del tratamiento con calor a una temperatura de 38º C durante 1 hora, se
obtuvo un rendimiento de 94.7% y 842.8 mg de proteína.
I
Imagen 7. Electroforesis en gel bidimensional de las fracciones agrupadas (10-30) después
de la cromatografía de intercambio iónico.
Análisis
Como primer método de separación de la proteína, se utilizó sulfato de amonio en
una concentración del 80 %. Se seleccionó de esta forma debido a que se obtenía
un mayor avance de purificación de la proteína, de la cual precipitó el 94.7%; se
observó el fenómeno de salting out, cuando a altas concentraciones de sal la
solubilidad decrece y la proteína precipita. Se decidió tomar el botón para continuar
con el proceso de purificación.
Posteriormente, se aplicó un tratamiento de calor de 38ºC por 1 hora, ya que
nuestra proteína es termoestable hasta los 50ºC por varias horas, sin embargo, no
excedió el límite de su estabilidad, puesto que se corría el riesgo de perder a la
proteína de interés. Este tratamiento se aplicó con el propósito de eliminar
impurezas u otras proteínas que no son de nuestro interés y que no muestran
estabilidad a la temperatura mencionada.
Se llevó a cabo una filtración por gel con Sephadex-G100, se eligió debido a que no
conocemos el tamaño de nuestra proteína pero sí el tamaño de la sal. Con la
filtración en gel se desaló la muestra y con ello también se filtraron otras proteínas
contaminantes.
El siguiente paso de la purificación implicó la utilización de una cromatografía por
intercambio iónico. El gradiente de sal ocasiona que los ligandos cargados
positivamente de la fase estacionaria interaccionen con analitos cargados
negativamente.
Conclusiones
Gallardo Hernández Mónica Daniela
En este trabajo nos hemos enfocado en la purificación de una proteína a partir de
una muestra en la que se incluían varias otras. Para tal fin, se diseñó un protocolo
con base en las propiedades que demostró tener nuestro objeto de estudio. La
división de la purificación en distintas fases nos permitió aislar a la proteína de
interés, desde el desalado con sulfato de amonio hasta el uso de un intercambiador
aniónico, que posibilitó la separación de fracciones activas. También es importante
mencionar que la electroforesis nos ayudó a conocer el peso molecular de la
proteína.
Martínez Hernández Zaira Lizbeth.
Se purificó la proteína 5 de una mezcla de 60 proteínas mediante el simulador
Agbooth, donde se aplicaron los conocimientos teóricos de los distintos métodos de
purificación y se obtuvo un protocolo de purificación para dicha proteína.
Sánchez Argüelles Altagracia
al finalizar la simulación para purificar proteínas, entendimos cada uno de los pasos
que se realizaron, fue un tanto difícil ya que desconociamos las propiedades de
nuestra proteína de interés, únicamente se nos proporcionó una breve explicación
de la estabilidad de esta, y con eso nos guiamos para purificarla.
Licea Andrade Miguel Angel
Al finalizar la sesión, y empleando diversas técnicas, se logró purificar la proteína de
interés de la mezcla inicial, que contenía más de 60 productos proteicos. Sin
embargo, es importante mencionar que el rendimiento sufrió una caída considerable
al emplear la cromatografía de afinidad. Esto pudo deberse a que no era la técnica
más adecuada o no se realizó correctamente, por lo que se sugiere reétir el
experimento.
Referencias
[1] Ramirez-Carreto, et al. (2021). Purificación de proteínas. Mens. Bioquím.
(45). pp. 35-47. Recuperado de
http://bq.facmed.unam.mx/tab/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purifi
cacion.pdf
● Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons
Inc, New York, USA. pp 71-104.
● Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición.
1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. pp 69-85. Localización
QP514.T4
Cuestionario
1. Menciona cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas
-Inmunización (vacunas)
-Tratamiento de enfermedades (fármacos)
-Diagnóstico de enfermedades
- Investigación
2. Dentro de la guía para purificar a una proteína se plantea que es importante
establecer cuál va a ser el uso final de la proteína purificada. Explica por qué.
● Caracterización de la actividad biológica de la proteína.
● Para estudios sobre la estructura función
● Establecer relaciones evolutivas entre organismos
3. ¿Qué propiedades de la lactato deshidrogenasa se aprovecharán en cada paso
de su purificación? (Ejemplos: carga, peso, solubilidad y unión a ligantes)
precipitación= concentración y solubilidad
tratamiento con calor= estabilidad a la temperatura
filtración por gel= peso y tamaño
cromatografía de intercambio iónico= carga
cromatografía de afinidad = unión a ligantes