Tecnológico Nacional de México «Ciencia es verdad, técnica es libertad»

Instituto Tecnológico de La Paz Agosto – Diciembre 2017

Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica [REPORTE DE PRÁCTICA]

Extracción de pr o t e í na s h i dr o s ol u bl e s de a t ún ( Th u n n us
a l ba c a r e s )
Alumno: Maruko Yasuo Kiyoshi, 14310939
Docente: Ingeniero. Geovanni Alberto Ruiz Romero
Mesa No.3
Bioquímica del nitrógeno y regulación genética, 7´H
Fecha: 2017-13-10

Resumen
El atún de aleta amarilla (Thunnus albacares) es un tipo de atún que se encuentra en las aguas abiertas de mares tropicales y
subtropicales por todo el mundo. La cantidad de proteínas del atún es de 23,50 g. por cada 100 gramos. El primer paso para
extracción de las proteínas celulares comienza con una ruptura celular o lisis. Los métodos más utilizados se basan esencialmente
en la homogenización de los tejidos y la destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o
químicos. Para la extracción y cuantificación de las proteínas de Thunnus albacares, se empleó el método de Bradford que es un
método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. Para la determinación de las proteínas se requiere emplear la
técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida.

Los objetivos esenciales del protocolo fueron cubiertos puesto que se conoció las técnicas extracción y cuantificación de proteínas
solubles, además se realizó una identificación de proteínas de la muestra por medio de la electroforesis en gel de poliacrilamida

Palabras clave: Proteínas hidrosolubles, cuantificación, electroforesis, extracción , identificación, atún.

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ITLP – Ingeniería bioquímica [2016] 1

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Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica
Introducción y objetivos
Atún
El atún de aleta amarilla (Thunnus albacares) es un tipo
de atún que se encuentra en las aguas abiertas de mares
tropicales y subtropicales por todo el mundo. Es un pez
de cuerpo fusiforme, más estilizado que otros atunes.
Tanto la cabeza como sus ojos son pequeños, y la
segunda aleta dorsal y la anal son las más largas de
todos los atunes; durante su madurez alcanzan mayor
tamaño.
La cantidad de proteínas del atún es de 23,50 g. por
cada 100 gramos. Las proteínas que tiene el atún, se
usan en nuestro organismo para crear nuevas proteínas,
responsables de construir tejidos, como los de nuestra
masa muscular, y regular los fluidos del organismo entre
otras funciones (Allara, 2001).
El primer paso fue extracción de las proteínas celulares que
comienza con una ruptura celular o lisis. Los métodos más
utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los
tejidos y la destrucción de los límites celulares por medio de
diferentes procedimientos físicos y/o químicos. Obteniéndose lo
que se denomina extracto crudo. Dicho extracto es nuestra base
de partida para realizar los análisis de cuantificación de
proteínas solubles.
Los métodos para la cuantificación de proteínas se basan en:
 Propiedad intrínseca de las proteínas para absorber
luz en el UV
 Para la formación de derivados químicos
 Capacidad de proteínas de unir ciertos colorantes
Las proteínas muestran un fuerte grado de absorción a 280 nm
en UV debido a los residuos de triptófano y la tirosina de las
proteínas, en presencia en sus anillos de grupos funcionales
orgánicos (método de absorción en UV) (Bradford, 1976)
Para la extracción y cuantificación de las proteínas de Thunnus
albacares, se empleó el método de Bradford que es un método
colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas.
El método de Bradford se desarrolla de la siguiente manera
La unión de un colorante azul brillante comassie G250 a las
proteínas. Este colorante existe en una solución ácida en dos
formas (azul otra naranja). Las proteínas se unen a la forma
azul y formar una complejo proteína colorante con un
coeficiente de extinción mayor al del colorante libre. Sensible
para proteínas con residuos arg, trp, tyr, his y Phe. Método
sensible (1-15 microgramos de proteína) las únicas sustancias
que pueden interferir son detergentes soluciones básicas.
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El cambio en la absorbancia a 595 nm es proporcional a la
concentración de la proteína en la muestra y se monitorea
midiendo el incremento de absorbancia.
Principio: el color rojo pasa a azul cuando se une a la proteína.
La formación del complejo colorante proteína toma
aproximadamente 2 minutos y permanece estable por 1 hora y
este complejo tiene un alto coeficiente de extinción molar lo que
hace al ensayo mucho más sensible. (Bradford, 1976)
Ventajas del método de Bradford:
 Rápido
 Más sensible que el método de lowry
 No existen interferencias de cationes como K, Na y Mg
 No interfiere el sulfato ni el amonio, polifenoles ni
carbohidratos como sacarosa
 Mide proteínas y péptidos con masa molecular de 4
KDa
Desventajas del método de Bradford
 El color varía con distintos tipos de proteínas
 Interferencia de detergentes
Para la determinación de las proteínas se requiere emplear la
técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de
soporte para separaciones electroforéticas, dado que reúnen
una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad,
porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de
compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por
copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-
acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción
iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato
de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su
vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Las
cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la
bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante
uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de
la reacción y las concentraciones de los monómeros. Entre las
diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE, por sus siglas en inglés "polyacrylamide gel
electrophoresis"), probablemente la más utilizada es la
modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente
duodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), tanto para analizar
mezclas de proteínas. En la técnica de SDS- PAGE, se mezclan
las proteínas con el detergente aniónico SDS para formar
complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La
cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su
tamaño: el SDS se une en una proporción aproximada de 1,4 g
SDS/g proteína. Los complejos proteína/SDS poseen una
estructura elipsoide o de bastón, donde la cadena proteica es
distendida y solubilizada por el detergente. Dado que la relación
final carga/masa queda constante para las distintas proteínas
(se anula su carga intrínseca), estas van a ser separadas en el
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gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de
peso molecular (PM): a menor tamaño, mayor movilidad de la
proteína, y viceversa. (Lomonte, 2009)
Objetivo de la práctica extraer y cuantificar proteínas del
musculo del atún. Lograr una extracción y cuantificación
de proteínas hidrosolubles, para la comparar los
resultados obtenidos con la bibliografía.
Materiales y métodos
Muestra: Atún (Thunnus albacares)
Figura 1. Partes principales de la Thunnus albacares
Extracción de proteínas hidrosolubles
Se procedió a cortar la muestra en pequeños segmentos y un
aproximado de 30 mg se colocó en un tubo eppendorf. Se
añadió 500 μL de buffer Tris (50 mM PH 8.2) y un volumen de
perlitas de vidrio (1/5 parte del tubo eppenforf), a continuación
se homogenizó con la utilización de un pistilo de vidrio durante 5
minutos y un minuto de enfriamiento en una baño de hielo.
Después se repitió 5 veces el procedimiento de homogenización.
Se colocó el tubo de eppendorf de la muestra en la centrifuga
Hermle z233 M-Z a 13000rpm durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
Se recuperó el extracto de proteínas solubles en un tubo de
eppendorf limpio y se conservó en congelación.
Este paso se realizó por duplicado
Cuantificación de proteínas: Método de Bradford
Se enumeran 10 tubos de ensaye y se realizan diferentes
diluciones con la solución estándar y agua destilada. De
acuerdo a la tabla 1. Haciendo por duplicado siendo el
blanco el tubo número 1.
Tabla 1. Diferentes disoluciones que fueron utilizadas por cada tubo de ensaye y
sus respectivos tubos eppendorf.
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Posteriormente se enumeran los 10 tubos eppendorf
donde se adiciona a cada tubo 200 μL de cada una de las
diluciones respectivas. Se agregan también 800 μL de reactivo
de Bradford después se mezclan cada uno de estos tubos y se
incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente en
obscuridad. Todo esto se hace por duplicado, pasados los 5
minutos se agregan de las muestras de los diferentes tubos
ependorff a celdas de 1 ml donde se mide la absorbancia en el
espectrofotómetro (Spectronic 20) con una longitud de onda de
595 nm.
Micro ensayo
Para la realización del método de Bradford es necesario realizar
una dilución 1:100, se toman 10 μL de muestra del tejido de
Thunnus albacares y se colocan en diferentes tubos eppenforf
respectivamente y después de le agregan 990 μL de agua
destilada.
Posteriormente se tomaran 200 μL de la disolución de la
muestra y se le agrega 2 ml de reactivo de Bradford. Se deja
reposar un poco para después leer la muestra en el
espectrofotómetro a longitud de onda de 595 nm en una celda
de 1 ml.
Este paso se realizó por duplicado.
Electroforesis en geles de poliacrilamida
Preparación del gel
En la Tabla 2 se describen las cantidades de soluciones
requeridas para la formación de geles para el sistema Mini-
Protean®3 de Bio-Rad con 12% y 4 % de entrecruzamiento.
Estas cantidades pueden adaptarse para otras cámaras de
diversa capacidad, conservando las proporciones. Los geles de
poliacrilamida utilizados, constan de dos partes y se preparan
sobre moldes verticales de vidrio; el gel superior (gel
concentrador) mide alrededor de 2 cm de longitud incluyendo
los pocillos para aplicar las muestras; el gel inferior (gel
separador) tiene un recorrido de unos 6 cm.
Tabla 2. Volumen de soluciones requeridas para la preparación del gel de
poliacrilamida al 12%, para el sistema Mini-Protean® 3 de Bio-Rad.
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Se preparó la solución monómero al 12%, en las siguientes Resultados

proporciones 3.5 mL de H2O destilada, 2.5 mL Buffer de
separación. Tris 1.5 M pH 8.8, 4 mL acrilamida/ bis, 100 µL de Tabla 3. Datos la curva de BSA para la cuantificación de proteínas.
SDS al 10%, posteriormente se agregó el persulfato de amonio
al 10% (PSA) y TEMED. A continuación, se limpió el equipo con Concentración (μg/ml) Absorbancia
agua destilada y se armó el sistema para electroforesis mini- 0 0
protean 3, además se adicionó el PSA y TEMED al monómero y 20 0.19
se mezcló suavemente. Se vació el gel al sistema y se añadió
metanol hidratado hasta que se observó una interface. Durante
40 0.26
45 minutos se polimerizó el gel. Se preparó la segunda solución 60 0.28
del monómero (empaquetamiento) al 4% en las siguientes 80 0.35
proporciones, 6.1 mL H2O, 2.5mL de Buffer de
100 0.41
empaquetamiento. Tris 0.5 M pH 6.8, 1.3 ml de acrilamida/bis,
100 µL de SDS al 10%, de igual forma que la primera solución, 150 0.51
se adicionó el PSA y TEMED al monómero y se mezcló 200 0.56
suavemente, se colocó el peine en el sistema y se vació el gel 250 0.6
hasta llenar los espacios vacíos entre los dientes. Se dejó
500 0.64
polimerizar 45 minutos. Luego, se enjuagó los pocillos con
agua destilada y se montó los geles en el aparato de
electroforesis. En un tubo de eppendorf se colocó 30 μL de
Gráfica 1. Curva de regresión estándar de BSA para la cuantificación de
muestra más 10 μL de buffer de disociación y se realizó una
proteínas.
ebullición durante 10 minutos para pre-desnaturalizarla. Se
llenaron las cámaras (superior e inferior) con el buffer de
reservorios diluido (1X) y se colocó la muestra pre- Albúmina Sérica Bovina
desnaturalizadas en los pocillos número 1 y 2. Una vez
cargadas las muestras, el soporte se colocó dentro de la 1
Absorbancia

cámara de corrida y se llenó, incluyendo el interior del soporte 0.8

de los geles, con solución búfer reguladora la cual contenía 0.6
glicina y SDS (búfer para corrida 1x). Los electrodos se 0.4
conectaron a la fuente de poder después de colocar la tapa 0.2
sobre la cámara de desarrollo. Para iniciar el desarrollo 0
electroforético, se energizó la fuente de poder aplicando una 0 200 400 600
corriente eléctrica de 110 Volts, y se detuvo el corrimiento al
transcurrir una hora. Para la tinción con Azul de Coomassie se
utilizó una solución de tinción compuesta por metanol (50%), Concentración (μg/ml)
ácido acético (10%), agua destilada (40%) y de Azul de
Coomassie (0.05%p/v), mientras que la solución 1 para Al realizarse este método (Bradford) se obtuvieron los datos
desteñido consistió de la misma mezcla con excepción del presentados a continuación
colorante, y la solución 2 para desteñido consistió de una
mezcla de agua desionizada (88%) ácido acético (7%) y  Coeficiente de correlación: R² = 0.68612
metanol (5%). Una vez concluida la corrida electroforética, se  Ordenada al origen: 0.2222
inició el procedimiento de revelado de los geles. Primeramente
Ecuación de la recta
se retiraron los geles de los cristales depositándolos en un
recipiente de plástico descartando el gel concentrador y dejando Y= 0.0011 X + 0.2222 (ec.1)
el gel separador para su tinción. Se agregó la solución para
tinción de Azul de Coomassie procurando que el gel quedará Después se procedió a colocar la muestra en el
totalmente sumergido. Para evitar los gases y olores que se espectrofotómetro spectronic 20 a una longitud de onda de 595
desprenden, el recipiente de plástico se tapó y se dejó tiñendo nm, la adsorción obtenida fue de 1 y 1.6 y se utilizó la ecuación
por un período de 2 horas. Se lavó el gel con agua destilada y de la recta para obtener la concentración, como se muestra a
se sumergió en solución de desteñido hasta que se visualizó las continuación:
bandas proteicas y eliminación del “back ground”.

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Cálculos bajo, de acuerdo con Torres (2013) se esperaría que este valor
fuera lo más cercano posible a 1.
Y: 0.0011 X + 0.2222 (ec.1)
Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
1= 0.0011 X + 0.2222 desnaturalizante.
1−0.2222
X= = 707.87 µ𝑔/𝑚𝑙 Como se muestran los resultados obtenidos en la figura 2 la
0.0011
electroforesis SDS-Page, no fueron satisfactorios puesto que se
La cantidad de concentración de solución fue 707.87 µ𝑔/𝑚𝑙 , presenta una irregularidad al no correr de forma adecuada, las
para la primera muestra. moléculas se quedaron a la mitad del desplazamiento. Esto se
debe a la muestra se encontraba muy concentrada la proteína
Y: 0.0011 X + 0.2222 (ec.2) no pudo realizar el recorrido a través de la matriz del gel
(Weber, 1969).
1= 0.0011 X + 0.2222
1.6−0.2222 Las causas de este problema pueden ser variadas, sin embargo
X= = 1252.25 µ𝑔/𝑚𝑙 existen tres posibilidades de lo que ocurrió, la primera es el
0.0011
hecho de que la concentración de gel es incorrecta y esto pudo
La cantidad de concentración de solución fue 1252.25 µ𝑔/𝑚𝑙, hacer que el gel corriera demasiado rápido. También el gel
para la segunda muestra. puede verse comprometido de otras maneras. Ya que si tiene el
gel cortes o burbujas, incluso una pequeña imperfección afectan
Electroforesis en geles de poliacrilamida
los resultados. La otra posible causa es que al cargar las
muestras, el exceso de la muestra pudo causar que se
Page-SDS
observaran manchas grandes o que se aparecieran más
Figura 2. Resultados obtenidos en la electroforesis PAGE-SDS en el pocillo número 3
pequeñas de lo que realmente son (Center, 2003).
(señalado), se muestra una tendencia irregular puesto que no corrió de manera correcta el gel
Susuki (1981) encontró que las proteínas del músculo del atún
se pueden dividir en tres grupos:

1 Proteínas estructurales (actina, miosina, tropomiosina y

actomiosina), que constituyen el 70-80 por ciento del contenido
total de proteínas (comparado con el 40 por ciento en
mamíferos). Estas proteínas son solubles en soluciones salinas
neutras de alta fuerza iónica (³ 0,5 M).

2. Proteínas sarcoplasmáticas (mioalbúmina, globulina y

Discusión
Curva estándar de ASB
Para la obtención de la curva se utilizó el método de Braford,
utilizando como patrón estándar una curva de calibración BSA,
pues el método Bradford es bastante sensible a la BSA
(Stoscheck, 1990).
Con los datos proporcionados se realizó la curva (gráfica 1) que
permitió determinar la ecuación de corrección de los datos
experimentales. Y tras colocar las muestras en el
espectrofotómetro (Spectronic 20) se obtuvo una absorbancia
de 1 y 1.6. Utilizando de La ecuación de la recta para la
cuantificación. y=0,0011x+0.2222: Se obtuvo una
concentración de 707.87 µg/ml y 1252.25 µ𝑔/𝑚𝑙, el coeficiente
de correlación, 𝑅2 = 0.68612 este valor debe ser lo más cercano
a 1, esto sugiere una relación lineal entre la absorbancia y la
concentración (variables). El 𝑅2 calculado indica que el 68 % de
la información está ajustada a la variable Y (absorbancia),
confirma además que el grado de relación entre las variables es
enzimas), que son solubles en soluciones salinas neutras de
baja fuerza iónica (0,15 M). Esta fracción constituye el 25-30 por
ciento del total de proteínas.
3. Proteínas del tejido conectivo (colágeno), que constituyen
aproximadamente el 3 por ciento del total de las proteínas.
Las proteínas estructurales conforman el aparato contráctil
responsable de los movimientos musculares. La composición de
aminoácidos es aproximadamente la misma que en las
correspondientes proteínas del músculo de mamíferos, a pesar
de que las propiedades físicas pueden ser ligeramente
diferentes. El punto isoeléctrico (pI) está alrededor del pH 4.5-
5.5. A estos valores de pH las proteínas presentan su menor
solubilidad.
La estructura conformacional de las proteínas de los peces es
fácilmente modificada mediante cambios en el ambiente físico.
En especial las proteínas miofibrilares después de una
congelación, deshidratación, tratamientos con altas
concentraciones salinas o temperaturas elevadas pueden
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causar cambios irreversibles en la estructura nativa de las Rådström, P. e. (2004). Pre-PCR processing: Strategies
proteínas. to generate PCR-compatible samples. . Mol.
Biotechnol. .
En la identificación de proteínas Se esperaba
encontrar hemoglobina (hasta 380 mg en 100 g de músculo) Susuki, T. (1981). Fish and Krill Protein: Processing
y mioglobina (hasta más de 530 mg en 100 g de músculo) ya
Technology. Applied Science Publ., Ltd,. London,
62-147.
que son las proteínas de mayor abundancia en el músculo del
atún (Brown, 1962). Weber, K. (1969). The Reliability of Molecular Weight
Determinations by Dodecyl Sulfate-
Conclusión Polyacrylamide Gel Electrophoresis. J.Biol. Chem.
Los objetivos esenciales del protocolo fueron cubiertos Vol 244 .
puesto que se conoció las técnicas extracción y
cuantificación de proteínas solubles, en el cual se obtuvo
la concentración proteica del tejido de atún (Thunnus
albacares), por medio del método de Bradford. Además
se realizó una identificación de proteínas de la muestra
por medio de la electroforesis en gel de poliacrilamida,
aunque no se lograron observar las proteínas presentes,
debido a los errores expuestos con anterioridad.
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