RESUMEN

En la actualidad, la biotecnologa ha tenido grandes aportaciones que han llevado a una mejora continua en los procesos de produccin, sobre todo para verificar la calidad de un producto, en industrias como la de productos qumicos, la de alimentos y farmacuticos. Los biosensores van de la mano con un organismo vivo desde que nace por que el organismo tiene la capacidad de sentir, esta gran virtud es utilizada para darle un poco de ese sentimiento a los equipos electrnicos, por tanto un biosensor es un dispositivo bioqumico-electrnico que permite identificar, convertir y cuantificar un suceso o elemento de origen biolgico. Est compuesto por la combinacin de un bioreceptor (componente biolgico) y un transductor, (mtodo de deteccin). Una muestra se analiza y obtenemos informacin que puede ser tratada y almacenada. Comnmente se utiliza una enzima inmovilizada como bioreceptor que convierte al analito en un producto que podr detectar el transductor. El transductor ser elegido segn el analito vaya a presentar alguna alteracin que podra ser la temperatura, masa, o turbidez entre otros. El transductor puede ser electroqumico, termomtrico, fotomtrico o piezoelctrico y de acuerdo al tipo de bioreceptor con el que se combina pueden formarse mltiples tipos de biosensores.

Biosensores y enzimas inmovilizadas

Un biosensor es un dispositivo compacto de anlisis que incorpora un elemento de reconocimiento biolgico (cido nucledo, enzima, anticuerpo, receptor, tejido, clula) o biomimtico (PIMs, aptmeros, PNAs) asociado a un sistema de transduccin que permite procesar la seal producida por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito. El principio de deteccin de un biosensor se basa en la interaccin especfica entre el compuesto o microorganismo de inters y el elemento de reconocimiento. Como resultado de esta unin se produce la variacin de una o varias propiedades fsico-qumicas (pH, transferencia de electrones, de calor, cambio de potencial, de masa, variacin de las propiedades pticas, etc.) que detecta el transductor. Este sistema transforma la respuesta del elemento de reconocimiento en una seal electrnica indicativa de la presencia del analito sometido a estudio o proporcional a su concentracin en la muestra.

Los biosensores se han desarrollados con el objetivo mtodos analticos y cuantitativos para determinar componentes especficos en una sustancia, un biosensor se compone de tres elementos: bioreceptor, transductor y procesador.

Fig. 1) Esquema que muestra los principales componentes que conforman un biosensor

I. EL BIORECEPTOR
El bioreceptor es crucial pues produce el efecto fsico-qumico que ser detectado por el transductor. Esto involucra procesos como biocatlisis, acoplamientos inmunolgicos o quimiorecepcin. 1. Tipos de bioreceptores Los bioreceptores ms empleados son: Catalizadores biolgicos (enzimas). Las enzimas pueden ser extradas de una o ms fuentes biolgicas (in situ) para aplicaciones especficas y pueden usarse solas o con sus cofactores. Las enzimas que se consiguen comercialmente presentan las siguientes ventajas: se reproducen por lotes, tiempo de vida y caractersticas conocidas, disponibilidad inmediata. Las desventajas de las enzimas purificadas son que no son siempre estables y necesitan la presencia de sus cofactores para operar en forma apropiada. En algunos casos se necesitan cadenas enzimticas para realizar las transformaciones, lo que debe asegurarse la operacin ptima del biosensor en forma global. Microorganismos. Son entidades estructurales que poseen todas las enzimas necesarias y sus cofactores en un ambiente optimizado por la naturaleza. Pueden reproducir y compensar prdidas en la actividad enzimtica con el tiempo.

Tejidos y organelas. El tejido tiene la ventaja de la cohesin, y tiene una estructura que es lo suficientemente robusta para adherirse a un transductor sin necesidad de recurrir a tcnicas de inmovilizacin de protenas. Pueden usarse: Tejidos de animales y vegetales: estos tejidos son fuentes naturales de material enzimtico por lo cual pueden construirse biosensores muy estables. Organelas: se pueden encontrar biocatalizadores en lisosomas, cloroplastos, mitocondrias y microsomas. Inmunorreceptores. Debido a la reaccin antgeno-anticuerpo se produce una dbil variacin del potencial que puede detectarse, pero deben utilizarse distintos procesos para mejorar la respuesta del transductor. Quimiorreceptores. Se emplean los receptores celulares especficos de membranas celulares que se excitan qumicamente para producir cambios conformacionales. Ej: neurorreceptores para detectar drogas y toxinas

2. Inmovilizacin de los bioreceptores

Para este tema nos interesan las enzimas inmovilizadas como bioreceptores. Las enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas en los seres vivos. En una reaccin catalizada por una enzima se produce una unin del sustrato en una regin concreta de la enzima denominada centro activo, que comprende un sitio de unin y un sitio cataltico. Una vez formados los productos la enzima se recupera pudiendo comenzar un nuevo ciclo de reaccin. En ocasiones puede ser necesaria la presencia de cofactores para que la enzima pueda regenerarse y estar activa de nuevo. La actividad enzimtica est controlada normalmente por el pH, la fuerza inica, la temperatura y la presencia de cofactores.

La estabilidad de las enzimas es un factor limitante para el tiempo de vida de un biosensor de tipo enzimtico y se utilizan distintas tcnicas para aumentarla, como estabilizacin qumica y/o inmovilizacin.

De este modo un paso crucial en la construccin de un biosensor es inmovilizar las protenas de inters como las enzimas. Esto asegura mximo contacto con la muestra, y estabilizacin de la protena para poder emplearla en forma repetida. La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente . Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte.

En general, los mtodos de inmovilizacin, se suelen clasificar en dos grandes categoras: 1) Retencin fsica 2) Unin qumica

INMOVILIZACION POR RETENCIN FISICA

MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA Atrapamiento Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.

Inclusin en membranas: Dividida en dos tipos: 1) Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, tambin llamadas micelas reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y 100 mm de dimetro. Mediante este mtodo se pueden encapsular simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos. 2) Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran inters en la industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de sustrato que atraviesa el reactor. En general, en esta metodologa, se procede inicialmente a la adsorcin de la enzima sobre la membrana que formar el reactor. Esta adsorcin se puede realizar de dos formas: 1. mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de la membrana; 2. por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.

INMOVILIZACION POR UNION QUIMICA

MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR UNIN QUMICA Unin a soportes Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, amplie el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos: 1. Soportes inrganicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.) 2. Soportes rganicos. Se pueden clasificar en: Polmeros naturales: a su vez divididos en: polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc). protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc). Polmeros sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol polivinlico, poliamidas, etc).

Adsorcin En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno. Los principales factores que influyen en la adsorcin, son: 1. el pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la protena y del slido; 2. la fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte que la protena; 3. el dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor de la enzima;

4. la presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimtica del derivado. Como principales ventajas de este mtodo destacan: 1. su preparacin sencilla, 2. su bajo coste, 3. no hay cambios de especificidad enzimtica, 4. los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua. Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente: 1. la optimizacin de las variables que controlan la adsorcin, 2. los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecnico, 3. la unin al soporte es dbil.

Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear resinas de intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.

Unin covalente La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. El resto de aminocidos, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente. Este mtodo presenta las siguientes ventajas: 1. La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla; 2. La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin; 3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado. 4. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.

En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de inconvenientes: 1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos. 2. El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo. 3. La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc. Reticulado Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas (7). El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. El co-reticulado, permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilizacin muy comn consiste en inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un soporte polimrico (con lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente aadir el reactivo bifuncional. Actualmente el mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la cristalizacin de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehdo (CrossLinked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtencin de un entramado cristalino, donde las molculas de enzima estn rodeadas exclusivamente por otras molculas de protena. De esta manera la propia enzima acta como soporte, y su estructura terciaria est estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscpicos (20-50) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reaccin. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, as como la accin de las proteasas. Esta tecnologa se ha aplicado a enzimas muy diferentes, las cuales se han utilizado en la obtencin de compuestos enatiomricamente puros y en la sntesis de pptidos.

EFECTOS DE LA INMOVILIZACIN A menudo, la inmovilizacin altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso cataltico (ph, sustratos, Productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) Se encuentran en interfase: en el medio de reaccin y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimtica se ve afectada por efectos de tipo difusional, estrico y del microentorno. EFECTOS EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede ser debido a que: 1. la unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo est impedido, 2. los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima, 3. la inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva, 4. las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin o desactivacin de la enzima. Si la prdida de actividad no es total despus de la inmovilizacin, los cambios (disminucin o aumento de la actividad enzimtica) se debern principalmente a efectos difusionales, electrostticos, estricos y/o del microentorno. 1) Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilizacin, la difusin de los sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno. a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula lquida estacionaria (capa de Nernst o de disfusin) que rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la concentracin de sustrato es menor que en el resto de la disolucin, puesto que existe un gradiente de concentracin a travs de la zona de difusin. Por tanto, los valores de km para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (km); b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada. Existen diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales (12) como por ejemplo: disminuir el tamao del biocatalizador, aumentar la concentracin de

sustrato, incrementar la agitacin o el flujo en el reactor, etc. Con estas medidas se consigue reducir el grosor de la capa de Nernst, y como consecuencia, el valor de km disminuye. 2) Efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsin mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atraccin. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en disolucin. Hornby y cols. (13) desarrollaron una expresin matemtica que permite calcular la actividad de las enzimas inmovilizadas, teniendo en cuenta tanto los factores de difusin como los electrostticos. 3) Impedimentos estricos o de tamao de sustrato. En un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una prdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser vlido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye drsticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes slidos, a pesar de que son muy activas frente a sustratos pequeos, muestran una actividad muy baja hacia protenas, polisacridos y cidos nucleicos . Este efecto estrico se puede evitar mediante una inmovilizacin covalente a travs de un brazo espaciador enzima-soporte ms largo. 4) Efectos en el microentorno (15): La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados elctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH ptimo de la catlisis enzimtica y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzimaunida a un soporte cargado negativamente tendr en su microentorno una concentracin mayor de hidrogeniones que en el medio de reaccin. Como resultado, la enzima inmovilizada ser ms activa a un pH ms alcalino. La enzima sera ms activa a pH ms cidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE ENZIMAS Y ANTICUERPOS COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO EN BIOSENSORES

ENZIMAS VENTAJAS Elevada sensibilidad. Respuesta rpida Autorregenerables Permiten monitorizacin continua No requieren pasos de lavado Gran variedad de enzimas disponibles Permiten detectar txicos desconocidos que inhiben enzimas Permiten amplificar seales. Diseo sencillo. Fcil construccin Bajo coste. Manejo sencillo. INCONVENIENTES Sensibilidad frente a condiciones ambientales(pH, temperatura o fuerza inica) En ocasiones requieren presencia de cofactores. Pueden ser inhibidos por sustancias de la muestra. Tiempo de vida limitado.

TRANSDUCTORES EMPLEADOS EN BIOSENSORES El transductor provee la evidencia de que ha ocurrido una reaccin en el bioreceptor. La eleccin del transductor depende del tipo de reaccin, y las sustancias liberadas o consumidas. Generalmente, la eleccin apropiada del transductor es el modelo comercial que existe para el mtodo de deteccin requerido. Hay un gran nmero de electrodos disponibles para deteccin electroqumica, por ejemplo, electrodos sensibles a pH, a aniones o cationes, y a gases (pO2, pCO2, pNH3). El componente sensible puede comprarse independientemente y luego adherirlo al biosensor. La eleccin del transductor tambin depende la aplicacin deseada del biosensor. Si va a ser usado en ambientes biolgicos, debe satisfacer criterios de biocompatibilidad, especialmente con respecto a la deposicin de protenas, lpidos o clulas sobre su superficie. Si va a ser utilizado invitro, debe ser de tamao reducido, y con forma adecuada para no daar excesivamente los tejidos. Adems deben tenerse en cuenta las caractersticas txicas, metlicas, o componentes polimricos cuando se va a implantar por largo tiempo. La interferencia qumica puede afectar la transduccin, por lo que tambin debe tenerse en cuenta en el momento de la eleccin del transductor. El transductor debe aprovechar ptimamente las modificaciones fisicoqumicas que resulten de las reacciones biolgicas. Por ejemplo, si una reaccin provoca una variacin de la entalpa, se produce un incremento muy dbil de la temperatura y por lo tanto un termistor es un transductor trmico ms adecuado que una termocupla. El mismo transductor puede usarse en modos de operacin diferentes, que se eligen de acuerdo al objetivo deseado. Por ejemplo, una fibra ptica puede usarse como un transductor extrnseco, con un componente biorreactivo inmovilizado en su punta, o como un transductor intrnseco explotando la interaccin entre las inmunoprotenas de su superficie y las ondas evanescentes de la superficie. Los transductores pueden ser: Electroqumicos Potenciomtricos Amperomtricos Semiconductores Termomtricos Piezoelctricos Fotomtricos Aplicaciones Empleando enzimas Deteccin y cuantificacin de organofosfatos: se emplea la enzima colinesterasa, la cual forma compuestos con los derivados organofosfatados, permitiendo su deteccin en fase gaseosa. El aumento de peso sobre el cristal se debe a los compuestos formados.

BIOSENSOR DE ENZIMA Un biosensor de enzima es la combinacin de un transductor y una capa delgada enzimtica, que se usa normalmente para medir concentracin de un sustrato. La reaccin enzimtica transforma el sustrato en un producto de reaccin que el transductor puede detectar. La concentracin de una sustancia se mide segn cmo afecte su presencia a la velocidad de reaccin enzimtica. Principios de operacin En la siguiente figura se presenta un biosensor de enzima. La superficie sensible del transductor est en contacto con una capa enzimtica, y se asume que no hay transferencia de masa a travs de esta interfase. La superficie externa de la capa enzimtica est inmersa en una solucin que contiene el sustrato bajo estudio. El sustrato migra hacia el interior de la capa y se convierte en productos de reaccin cuando reacciona con la enzima inmovilizada. Para alcanzar un rpido equilibrio de concentracin la membrana enzimtica debe ser tan delgada como sea posible. La solucin debe agitarse para asegurar un suministro constante de sustrato. En resumen, los diferentes pasos son: 1. Transporte del sustrato desde el seno de la solucin hacia la capa enzimtica. 2. Difusin del sustrato en esta capa, acompaado por la transformacin enzimtica del sustrato en productos de reaccin. 3. Migracin del producto hacia el transductor. 4. Conversin de la concentracin del producto en esta superficie en una seal elctrica por el transductor. Los biosensores basados en enzimas pueden formarse usando principios de transduccin electroqumicos, pticos, trmicos o gravimtricos. Los basados en principios electroqumicos se denominan electrodos de enzima y miden la formacin de un producto o el consumo de un sustrato, si el producto o sustrato es electroactivo.