CROMATOGRAFÍA

CROMATOGRAFÍA
Técnica de separación que se basa en la diferente afinidad que tienen las
moléculas por un disolvente y por la trama porosa de la matriz a través
de la cual fluyen

COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO

FASE FIJA O ESTACIONARIA

Constituida generalmente por un sólido granular finamente dividido;

también puede ser un líquido.

FASE MÓVIL

Transporta los solutos; gas o líquido.

SUSTRATOS O SOLUTOS
Sustancias (2 o más) a separar.
CROMATOGRAFÍA DE PAPEL
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
 FUNDAMENTOS DE LA
CROMATOGRAFÍA
• La movilidad de cada soluto depende de
un equilibrio en la distribución entre la fase
móvil y la estacionaria.

• La separación se puede realizar en

función de sus cargas, masas, tamaños
moleculares, la polaridad de sus enlaces,
sus potenciales redox.
 FUNDAMENTOS DE LA
CROMATOGRAFÍA

Las moléculas que "prefieren

disolverse“ en la fase móvil serán
eluídas más rápido que las que son
preferencialmente solubles en la fase
estacionaria y que tienden a quedar
retenidas.
 FUNDAMENTOS DE LA CROMATOGRAFÍA
Hay una gran variedad de técnicas para llevar a cabo la
separación de una sustancia; se clasifican en cuatro grandes
grupos, según el mecanismo de separación:

• C. de reparto: separa los solutos basándose en la

solubilidad.

• C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción.

• C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular.

• C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga

iónica.
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

I. FORMA DEL LECHO CROMATOGRÁFICO

II. ESTADO FÍSICO DE LAS DOS FASES

III. ESTADO FÍSICO DE LA FASE MÓVIL

IV. MECANISMO DE SEPARACIÓN

V. TÉCNICAS ESPECIALES
I. Según estructura mecánica del recorrido de
separación o de acuerdo a la forma del lecho
cromatográfico
1.En columna.

• “En columna”.- La fase móvil es líquida.

• “Gaseosa”.- La fase móvil es gaseosa.

2. En capas (CROMATOGRAFIA PLANA O DE LECHO ABIERTO); la fase

estacionaria está presente como o sobre un plano.

• Cromatografía en papel

• Cromatografía en capa fina (Fase estacionaria hasta 300 m)

• Cromatografía preparativa en capa (Grosor de las capas, mayor

de 300 m.
 II. Según el estado físico de las dos fases
En esta clasificación se menciona primero a la fase móvil.

2.1 Cromatografía líquido-líquido (LLC)

Fase móvil : Líquida

Fase estacionaria (s) : Líquida

2.2 Cromatografía gas-líquido (GLC)

Fase móvil : gaseosa

Fase estacionaria : líquida

2.3 Cromatografía gas–sólido (GSC)

Fase móvil : gaseosa

Fase estacionaria : sólida

2.4 Cromatografía líquido-sólido (LSC)

Fase móvil : Líquida

Fase estacionaria : sólida
III. De acuerdo al estado físico de la fase móvil

3.1 Cromatografía Gaseosa

La fase móvil es un gas. Esta cromatografía siempre se

realiza en una columna.

3.2 Cromatografía líquida

La fase móvil es un líquido. Esta cromatografía puede

ser realizada en una columna o en un plano (papel,
vidrio, plástico).

3.3 Cromatografía de Fluido Supercrítico

La fase móvil (líquido o gas) es un fluido cuya

temperatura y presión están por encima pero cerca de
sus valores críticos:
Temperatura crítica (Tc):

Máxima temperatura a la cual un gas puede ser

convertido a líquido por un incremento en la
presión.

Presión crítica (Pc):

La mínima presión que sería suficiente para

licuar un gas a su temperatura crítica. Por
encima de esta presión, aun elevando la
temperatura, el líquido no podría pasar a la
forma de vapor para dar un sistema de dos
fases.
 IV. Según el tipo o mecanismo de separación (1)

4.1 Cromatografía de separación o de partición

Cuando los componentes a separar se pueden distribuir entre las

dos fases

4.2 Cromatografía de adsorción

No se produce una distribución dentro de la fase estacionaria, lo que

tiene lugar es una adsorción. La separación se basa en las
diferencias de afinidad de los compuestos a separar por la superficie
de un sólido activo.

4.3 Cromatografía por tamices moleculares

La fase estacionaria está formada por cuerpos inorgánicos sólidos

porosos. Las moléculas más grandes no se pueden introducir en los
poros, por lo que permanecen en la fase móvil y abandonan primero
el sistema cromatográfico. Las moléculas pequeñas sí penetran, y
cuanto más pequeñas más profundamente, de forma que a causa del
largo camino a recorrer, son retenidas mejor.
 IV. Según el tipo o mecanismo de separación (2)

4.4 Cromatografía en gel

La fase estacionaria ( la matriz) está formada por sustancias

orgánicas.

4.5 Cromatografía de intercambio iónico

La separación se basa principalmente en las diferencias en

las afinidades de intercambio iónico de los componentes de
la muestra.

Se anclan sobre el soporte (fase estacionaria) grupos

funcionales ionizables (grupos de anclado). La parte no
separable de un grupo de este tipo se llama ION INSOLUBLE
y el iónico separable CONTRAION. Este CONTRAION puede
ser intercambiado.
 V. Técnicas especiales (1)

5.1 Cromatografía de Fase Reversa

La fase móvil es significativamente más polar que la fase

estacionaria.

5.2 Cromatografía de Fase Normal

.
La fase estacionaria es más polar que la fase móvil..

5.3 Elución en Gradiente (Gradient elution)

Se cambia continuamente la composición de la fase móvil.

5.4 Elución Escalonada (Stepwise elution)

La composición de la fase móvil es cambiada en pasos o

escalonadamente durante una corrida cromatográfica simple.
 V. Técnicas especiales (2)

5.5 Cromatografía Bi-Dimensional

Los componentes separados son sometidos a separaciones

adicionales.

Por ejemplo, conduciendo una fracción particular del eluído de la

columna dentro de otra columna (sistema) con diferentes
características de separación

En cromatografía plana, los componentes se hacen migrar primero en

una dirección y subsecuentemente en una dirección en ángulo recto a
la primera dirección; las dos eluciones se llevan a cabo con
diferentes eluyentes.

5.6 Cromatografía Isotérmica

La temperatura de la columna se mantiene constante durante la

separación.
 V. Técnicas especiales (3)

5.7 Cromatografía a Temperatura Programada

La temperatura de la columna es cambiada sistemáticamente durante parte o

todo el proceso de separación.

5.8 Cromatografía de Flujo Programado

La velocidad de flujo de la fase móvil es cambiada sistemáticamente durante

parte o todo el proceso de separación.

5.9 Cromatografía de Presión Programada

Presión de fase móvil es cambiada sistemáticamente durante parte o todo el

proceso de separación.
 V. Técnicas especiales (4)
5.10 Cromatografía de Reacción

Las características (identidad) de los componentes de la muestra son

intencionalmente cambiadas en el lapso entre la introducción de la
muestra y la detección: al inicio o al final.

a) Cromatografía Gaseosa de Pirrolisis (Pyrolysis Gas

Chromatography)

La muestra, antes de entrar a la columna, es térmicamente

descompuesta hasta fragmentos más simples.

b) Derivatización Post-Columna

Los componentes de la muestra separados, eluyendo de la columna

son derivatizados antes de entrar al detector.

La derivatización también puede ser realizada fuera del sistema, antes de

que la muestra entre a la columna o al medio planar; ésta es la
DERIVATIZACIÓN PRE-COLUMNA (PRELIMINAR).
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

• La muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar

en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda,
punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la acción de
fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de
hidrogeno, efectos inductivos, etc).

• Los adsorbentes más utilizados son gel de sílica, alúmina, tierra

silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se
utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas
placas tienen indicador de fluorescencia.
 Cromatografía en Columna

Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de Magnesio.

La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual queda soportado en
el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio.

La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la

fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza
constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la
parte superior de la columna.

La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra

retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas
pueda ejercer con la fase estacionaria.

Las sustancias se separan gradualmente formando bandas; la separación, y por tanto

la resolución, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada
sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales,
disminuyendo por tanto la resolución.
 Cromatografía Liquida de alta eficiencia o
rendimiento (HPLC)

 Alta presión (entre 1500 a 2200 psi).

 Tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras.

 Longitud de la columna, entre 5 y 25 cm.

 Componentes de un sistema de HPLC: mezcladora de solventes, inyector, y una bomba que

inyecte el líquido a la columna.

 Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea
adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el
inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector,
generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia, y si se desea recuperar las
moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se

realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite

estandarizar la cromatografía, identificar la naturaleza los picos

eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su

"tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los

compuestos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno

de ellos se determina calculando el área la curva del pico

correspondiente.
CRÒMATÓGRAFO HPLC
CRÒMATÓGRAFO HPLC
 Cromatografía de gases.
 Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas.

 La Fase Móvil es un Gas (Gas Portador) y la Fase Estacionaria

puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película
de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-
Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía
Gas-Líquido).

 El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un

suministro y una entrada del gas portador, un puerto de
inyección, una columna (long. 1-15 m; diam. 2-4 mm)
normalmente localizada en el interior de una cámara
termostatizada (horno), un detector y un sistema
computarizado para analizar, registrar e imprimir el
cromatógrama.
 Cromatografía de gases.
La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio
donde ocurre la separación.

La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna, por
esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser
capaz de minimizar la difusión gaseosa.

Al final de la columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las sustancias,
midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una
señal tipo eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador
permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes.

La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan

medidas como la altura y el área del pico.
CROMATOGRAMA
CROMATÓGRAFO DE GASES
 Cromatografía de intercambio iónico
La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene
grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas
(Cationes o Aniones);

la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En

proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las
diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas
a un valor de pH determinado.

La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna está

influída por el pH y por la concentración de iones en solución
(concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con
la matriz.

La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse

gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase
móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.
PRINCIPIO DE LA CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Cromatografía por Permeabilidad en Gel

La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de

filtración en gel, separa en función de su tamaño.

Es útil para la separación de proteínas.

La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado

con poros de tamaños determinados.

Proteínas de mayor tamaño migran más deprisa que las de pequeño

tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en
los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más
corta y directa a lo largo de la longitud de la columna.

Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a

lo largo de la columna es más lenta.
Cromatografía por Permeabilidad en Gel
FIN