CROMATOGRAFIA

Mg. Giancarlo Alvarez

 CONCEPTO
• La cromatografía es una técnica de laboratorio para la separación de una
mezcla. La mezcla se disuelve en un fluido llamado fase móvil, que lo transporta
a través de una estructura que contiene otro material llamado fase estacionaria.
• Los diversos componentes de la mezcla viajan a diferentes velocidades, lo que
hace que se separen. Las sutiles diferencias en el coeficiente de partición de un
compuesto dan como resultado una retención diferencial en la fase estacionaria
y por lo tanto, afectan la separación.
• La cromatografía puede ser preparativa o analítica. El propósito de la
cromatografía preparativa es separar los componentes de una mezcla para un
uso posterior ósea una forma de purificación. La cromatografía analítica sirve
para establecer la presencia o medir las proporciones relativas de analitos en
una mezcla.
 HISTORIA
• La cromatografía se empleó por primera vez en Rusia por el científico italiano Mikhail
Tsvet en 1900. Continuó trabajando con la cromatografía en la primera década del siglo
XX, principalmente para la separación de pigmentos de plantas como clorofila,
carotenos y xantofilas. Dado que estos componentes tienen diferentes colores (verde,
naranja y amarillo respectivamente) dieron su nombre a la técnica. Los nuevos tipos de
cromatografía desarrollados durante los años 1930 y 1940 hicieron que la técnica fuera
útil para muchos procesos de separación.
• La técnica de cromatografía se desarrolló sustancialmente como resultado del trabajo
de Archer John Porter Martin y Richard Laurence Millington Synge durante las décadas
de 1940 y 1950, por la cual ganaron el Premio Nobel de Química en 1952. Establecieron
los principios y las técnicas básicas de la cromatografía de particiones y su trabajo
fomentó el rápido desarrollo de varios métodos cromatográficos: cromatografía en
papel, cromatografía de gases y lo que se conocería como cromatografía líquida de alta
resolución.
 TERMINOLOGIA
• El analito es la sustancia a separar durante la cromatografía. También
es normalmente lo que se necesita de la mezcla.
• La cromatografía analítica se usa para determinar la existencia y
posiblemente también la concentración de analito(s) en una muestra.
• Un cromatógrafo es un equipo que permite una separación sofisticada
por cromatografía de gases o cromatografía líquida.
• Un cromatograma es la salida visual del cromatógrafo. En el caso de
una separación óptima, diferentes picos o patrones en el
cromatograma corresponden a diferentes componentes de la mezcla
separada.
CROMATOGRAMA DE DOS
COMPUESTOS
• La cromatografía es un método físico de separación que distribuye
componentes para separar entre dos fases, una estacionaria (fase
estacionaria) y otra (la fase móvil) moviéndose en una dirección
definida.
• El efluente es la fase móvil que sale de la columna.
• El eluyente es el solvente que transporta el analito.
• El eluido es el analito, el soluto.
• Una serie eluotrópica es una lista de disolventes ordenados de
acuerdo con su poder de elución.
• La fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un
líquido, un gas o un fluido supercrítico. La fase móvil consiste en la muestra
que se separa/analiza y el disolvente que mueve la muestra a través de la
columna.
• La fase estacionaria es la sustancia fija en su lugar para el procedimiento de
cromatografía.
• En el caso de HPLC, la fase móvil consiste en un(os) disolvente(s) no polar(es)
tal como hexano en fase normal o un disolvente polar tal como metanol en
cromatografía de fase inversa y la muestra que se separa. La fase móvil se
mueve a través de la columna de cromatografía (la fase estacionaria) donde
la muestra interactúa con la fase estacionaria y se separa.
• El tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito
particular en pasar a través del sistema (desde la entrada de la columna
hasta el detector) en las condiciones establecidas.
• La muestra es la materia analizada en cromatografía. Puede consistir en
un solo componente o puede ser una mezcla de componentes. Cuando
la muestra se trata en el curso de un análisis, la fase o las fases que
contienen los analitos de interés se denominan muestra.
• El disolvente se refiere a cualquier sustancia capaz de solubilizar otra
sustancia.
• El detector se refiere al instrumento utilizado para la detección
cualitativa y cuantitativa de analitos después de la separación.
 TIPOS
• Existen mas de una decena de cromatografías sin embargo todas se basan
en los mismos principios, entre las mas utilizadas tenemos:
• Cromatografía de capa fina: La cromatografía en capa fina (TLC) es una
técnica de laboratorio ampliamente utilizada para separar diferentes
productos bioquímicos en función de su tamaño. Implica una fase
estacionaria de una capa delgada adsorbente como el sílica gel, alúmina o
celulosa sobre un sustrato plano inerte. La TLC es muy versátil ya que
múltiples muestras se pueden separar simultáneamente en la misma capa,
por lo que es muy útil para aplicaciones de detección como la prueba de
niveles de drogas. En comparación con otras tiene la ventaja de ejecuciones
más rápidas, mejores separaciones, mejor análisis cuantitativo y la elección
entre diferentes adsorbentes.
 TIPOS
• Cromatografía en columna: Es una técnica de separación en la que la
fase estacionaria está dentro de un tubo. Las partículas de la fase
estacionaria sólida o el soporte recubierto con una fase estacionaria
líquida pueden llenar todo el volumen interno del tubo o
concentrarse en lo largo de la pared interior del tubo, dejando un
camino abierto e irrestricto para la fase móvil en la parte media del
tubo. Las diferencias en las tasas de movimiento a través del medio
significaran diferentes tiempos de retención los analitos en la
muestra.
TLC y CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
 TIPOS
• Cromatografía Liquida: La cromatografía líquida (LC) se puede llevar a cabo en
una columna. La cromatografía líquida actual que generalmente utiliza
partículas de empaquetamiento muy pequeñas y una presión relativamente
alta se denomina cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En HPLC, la
muestra es forzada por un líquido a alta presión (la fase móvil) a través de una
columna que está empaquetada con una fase estacionaria compuesta de
partículas de forma irregular o esférica, una capa monolítica porosa o una
membrana porosa. HPLC se divide históricamente en dos subclases diferentes
basadas en la polaridad de las fases móvil y estacionaria. Los métodos en los
que la fase estacionaria es más polar que la móvil se denominan cromatografía
líquida de fase normal (NPLC) y en los que la fase móvil es mas polar que la
estacionaria se denomina cromatografía líquida de fase inversa (RPLC).
HPLC
 TIPOS
• Cromatografía de gas: La cromatografía de gases (GC), también conocida como
cromatografía gas-líquido (GLC), es una técnica de separación en la que la fase móvil es un
gas. La separación por cromatografía de gases siempre se lleva a cabo en una columna.
Hay dos tipos, las columnas empaquetadas son para trabajo de rutina, son más baratas y
fáciles de usar y a menudo ofrecen un rendimiento adecuado. Las columnas capilares
generalmente ofrecen una resolución muy superior y aunque son más caras, se utilizan
ampliamente, especialmente para mezclas complejas. Ambos tipos de columna están
hechos de materiales no adsorbentes y químicamente inertes. El acero inoxidable y el
vidrio son los materiales habituales para las columnas compactas y el cuarzo o sílice
fundida para columnas capilares. La cromatografía de gases se basa en una fase
estacionaria líquida o viscosa (a menudo un material líquido a base de silicona) y un gas
móvil (con mayor frecuencia helio). Es ampliamente utilizado en química analítica aunque
las altas temperaturas usadas en GC lo hacen inadecuado para muchos procesos
bioquímicos, pero es muy adecuado para su uso en los campos petroquímicos, de
monitoreo y remediación ambiental y de productos químicos industriales.
 TIPOS
• Cromatografía de afinidad: Se basa en la interacción selectiva entre un analito y moléculas
específicas y es muy específico. A menudo se usa en bioquímica en la purificación de proteínas.
Estas proteínas de fusión están marcadas con compuestos tales como biotina o antígenos, que se
unen específicamente a la fase estacionaria. La cromatografía de afinidad a menudo utiliza la
afinidad de una biomolécula por un metal (Zn, Cu, Fe, etc.).
• Cromatografía de intercambio iónico: La cromatografía de intercambio separa los analitos en
función de sus cargas respectivas. Por lo general se realiza en columnas. La cromatografía de
intercambio iónico utiliza una fase estacionaria cargada para separar compuestos cargados que
incluyen aniones, cationes, aminoácidos, péptidos y proteínas. En los métodos convencionales,
la fase estacionaria es una resina de intercambio iónico que transporta grupos funcionales
cargados que interactúan con grupos del compuesto a cargar opuestos para retener. Hay dos
tipos de cromatografía de intercambio iónico: Intercambio Catiónico e Intercambio Anicónico. En
la cromatografía de intercambio catiónico, la fase estacionaria tiene carga negativa y el ion
intercambiable es un catión, mientras que en la cromatografía de intercambio aniónico la fase
estacionaria tiene carga positiva y el ion intercambiable es un anión.
 TIPOS
• Cromatografía de exclusión por tamaño: Separa las moléculas de
acuerdo con su tamaño. Las moléculas más pequeñas pueden entrar
en los poros de los medios y por lo tanto, las moléculas quedan
atrapadas y se eliminan del flujo de la fase móvil. El tiempo de
residencia promedio en los poros depende del tamaño efectivo de las
moléculas de analito. Sin embargo, las moléculas que son más
grandes que el tamaño medio de poro del empaque están excluidas y
por lo tanto no sufren retención prácticamente; tales especies son las
primeras en eluirse.
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
 TIPOS
• Cromatografía bidimensional: En algunos casos, la química dentro de
una columna dada puede ser insuficiente para separar algunos
analitos. Es posible dirigir una serie de picos no resueltos en una
segunda columna con diferentes propiedades fisicoquímicas. Puede
ser es posible separar compuestos por cromatografía bidimensional
que no se distinguen por cromatografía unidimensional.
La muestra se observa en una esquina de una placa cuadrada, se
desarrolla, se seca al aire, luego se gira 90 ° y generalmente se vuelve
a desarrollar en un segundo sistema de disolvente.
DISTINTOS CROMATOGRAFOS