UNIVERSIDAD TCNICA DE MANAB
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA LABORATORIO CLNICO
INSTRUMENTACIN AL LABORATORIO
TRABAJO GRUPAL
INTEGRANTES:
BOWEN VERA SILVIA
SANTANA ALAVA GABRIELA
DOCENTE:
DR. ALBERTO CAMPOS GARCA
PARALELO:
SEGUNDO A
LA CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
Se utiliza el trmino de
Es un tipo de cromatografa Cromatografa de exclusin por
lquida en la cual la fase tamao.
estacionaria es slida y la fase
mvil es lquida
Tambin se denomina cromatografa de
permeabilidad sobre gel (GPC) o de
permeacin en gel. Su principal aplicacin es la
separacin de las molculas en funcin de su
tamao con la finalidad de estudiar el peso
molecular y distribucin de los polmeros3
Las principales caractersticas de Fase estacionaria es inerte, por lo
esta tcnica cromatografca son: que la columna no se desactiva.
La muestra no interacciona
qumicamente con la fase
estacionaria, ni con la fase mvil.
Los solutos son generalmente
sustancias de peso molecular
elevado (mayores de 2000).
Dependiendo de su medida y
estructura, stos se retienen o se
eluyen a travs de la columna.
No se pueden emplear gradientes
de elucin en la fase mvil.
CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
CARACTERSTICAS DE LA
CAMPO DE APLICACIN
RESTRINGIDO
SEPARACIN DE UN SOLUTO
ANALTICO
(PROTEINA)
ALTA SELECTIVIDAD EN EL
MECANISMO DE RETENCIN
LA CROMATOGRAFA DE
AFINIDAD
Se basa en la interaccin,
(llamada
especfica y reversible, que
genricamente
se presenta entre una
afinante)
partcula de inters.
Con alguna molcula particular
que va a ser inmovilizada en un
soporte slido (a esta partcula se
le conoce como ligando)
CROMATOGRAFA DE GASES
En cromatografa de gases la La elucin se produce por el flujo de una fase
muestra se volatiliza y se inyecta mvil que es un gas inerte, y a diferencia de la
en la cabeza de una columna mayora de los tipos de cromatografa, la fase
cromatogrfica. mvil no interacciona con las molculas del
analito; su nica funcin es la de transportar el
analito a travs de la columna.
Reparticin o distribucin repetida de analitos en dos
fases diferentes.
FM= Gas portador inerte (He, Ni)
Lleva los s componentes
No interacta con los analitos
( a PV, dependiente de
T y la interaccin con la FE)
Los componentes deben ser voltiles
NV Reacciones de derivatizacin
INSTRUMENTACIN DE LA CROMATOGRAFA DE
GAS
Mtodo de inyeccin
Velocidad de flujo
Temperatura
RENDIMIENTO
SISTEMA DE CONTROL
TIPOS DE CROMATOGRAFA DE
GAS
CROMATOGRAFA GAS- CROMATOGRAFA GAS-
SLIDO (GSC) LQUIDO (GLC)
Separacin basada en absorcin Cromatografa de particin
y desorcin.
FE es una sustancia liquida
FE es una capa de slido
absorbente simple. Fines analticos
Almina, slica. C. capilares y empaquetadas
un solido poroso C. Empaquetadas
Tamiz molecular FE NV, pelcula delgada sobre un
soporte: Tierra de diatomeas
Anlisis de gases areos.
(Kieselguhr)
C. empaquetadas y capilares
C. Capilares
(PLOT)
Liquido en la pared interna de la C. (WCOT)
o en una capa de material poroso (SCOT)
CONTROL DE PRESIN REGULADOR DE
PRESIN
MEDIDOR DE FLUJO
ROTAMETRO
CROMATOGRAFA LIQUDA DE ALTA
RESOLUCIN
Es un mtodo de separacin analtica, que se lleva a cabo gracias a la infinidad que tiene un compuesto (analito), por una
fase fija o estacionaria, o por una fase mvil.
FENMENOS POR LOS CUALES OCURRE UNA SEPARACIN EN
HPLC.
1. Adsorcin. Fenmeno de superficie que ocurre por la interaccin fsica o
qumica de un adsorbente de un adsorbato.
2. Particin. Es el fenmeno de reparto de un soluto en dos fases distintas.
3. Intercambio Inico. Es un fenmeno generado por la interaccin
electrosttica entre molculas cargadas elctricamente.
4. Exclusin. Es un fenmeno fsico que consiste mas que nada en separar
molculas en base a su tamao molecular.
5. Afinidad. Se combina la alta especificidad de ciertas molculas por un
sustrato, tales como Ab, Enzimas, Receptores, etc.
1.- fase Estacionaria (FE). Su naturaleza debe ser no polar. La fase estacionaria a base de Silice (SiO2) debe estar
recubierta con C6, C8, C12, C18, y adems puede tener un segundo recubrimiento con grupos Fenilo, Ciano, u otros que
hacen a la FE mas resistente a solventes polares como H2O, Metanol, etc. (fase enlazada).
2.- Fase Mvil (FM). Su naturaleza debe ser polar o mas polar que la FE, los disolventes pueden ser H2O, Metanol,
Etanol, etc.
3.- Analito. Debe ser no polar o no tan polar como la FM para poder ser retenido por la FE.
INSTRUMENTACIN
1. Reservorio. Contiene la Fase Mvil.
2. Bomba. Impulsa a la Fase Mvil dentro del Sistema de elucin
de HPLC.
3. Inyector (Automostrador o Manual). Permite introducir la
muestra al sistema.
4. Columna (Precolumna, Guardacolumna, y Horno). Sistema de
anlisis.
5. Detector. Es un transductor que tiene como funcin el registro
del paso de componentes de una muestra en el orden en el que
eluyen.
6.- Colector de Fracciones. Sirve para recibir o contener por
separado los componentes que ya eluyeron por si se requiere un
anlisis posterior de alguno de ellos.
7.- Computador. Sistema de almacenamiento.
1.- Consideraciones del Reservorio
Frasco cerrado de vidrio o de algn polmero resistente al
disolvente con paredes homogneas.
Contiene un filtro de metal poroso que ayuda a retener
partculas de tamao mayor a 10um.
Previo al bombeo del disolvente hacia el sistema de HPLC, se
realiza un tratamiento por desgasificacin por ultrasonicacin o
burbujeo con un gas inerte. (he excelencia).
Consideraciones del Disolvente
El disolvente debe ser de alta pureza (grado HPLC).
Disolver el analito.
Tener baja viscosidad.
No debe reaccionar con el empaque de la columna.
Debe ser voltil.
Polaridad adecuada para el tipo de anlisis que se lleve a cabo.
2.- Bombas
Impulsan a la FM hacia el sistema de HPLC.
Generan presiones de hasta 6000 psi (Ib/in2).
Tienen flujo libre de pulsaciones, evitando as la variacin de presin dentro
del sistema.
Tienen intervalos caudal de 0.1 a 10ml/min.
Tipos de Bombas
Binarias: impulsan un solo disolvente hacia el sistema.
Secundarias: impulsan dos disolventes hacia el sistema.
Terciarias: impulsan tres disolventes hacia el sistema.
Secundarias: impulsan cuatro disolventes hacia el sistema.
3.- Inyector
Permite introducir la muestra al sistema de HPLC para su anlisis sin
despresurizar el sistema y sin interrumpir el caudal.
La muestra se introduce en el Loop, el cual se encarga de introducir la
muestra al sistema.
Tiene una posicin de carga y otra de inyeccin.
La electroforesis es un mtodo
analtico semipreparativo, en el
que se separan biomolculas, en
dependencia entre otros factores de
su carga y bajo la accin de un
campo elctrico.
Las biomolculas se separan en funcin de:
Carga elctrica.
Tamao y forma.
A mayor carga, mayor movilidad.
A mayor tamao, menor movilidad.
A mayor viscosidad del medio, menor movilidad.
Separacin de especies cargadas
Electroforesis
(anin (-) y catin (+)).
Influencia de campo
cargado elctricamente Movimiento al ctodo (-) o
al nodo (+).
- +
nodo Ctodo
+ - + -
Los mtodos electroforticos son de alta sensibilidad, eficacia, poder de
resolucin y versatilidad.
Mtodo de separacin de:
Protenas
cidos nucleicos
Otras biomolculas
Permite detectar:
Peso molecular de una protena
Punto isoelctrico
Distinguir molculas para su carga neta o su forma.
ELECTROFORESIS DE La disolucin a tratar se aplica como una mancha, o como una banda, y las
partculas migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio de
soporte inerte y homogneo, tal como el papel o ciertos tipos de geles.
Esta tcnica es utilizada para analizar mezclas, para determinar la pureza de
una muestra, para detectar cambios de movilidad o de conformacin.
ZONA
PRINCIPALES SOPORTES PARA LA ELECTROFORESIS
Papel Agar Poliacrilamida
Membranas
de acetato de Agarosa
celulosa
Geles de: Almidn
Uno de los problemas de la electroforesis de zona es el flujo electroendosmtico,
que se debe a la presencia de grupos cargados sobre la superficie del medio de
soporte.
Por ejemplo: el papel tiene algunos grupos de carboxilo, la agarosa, grupos
sulfato, y la superficie de las paredes de vidrio que se utiliza en la electroforesis
capilar contiene grupos silanol (Si-OH).
Los iones positivos del amortiguador forman nubes de carga alrededor de las cargas negativas
inmviles de los soportes. Cuando se aplica la corriente elctrica, mientras las cargas
negativas permanecen fijas, las positivas, muy hidratadas, se mueven hacia el polo opuesto, lo
que produce el movimiento del solvente.
Como las macromolculas que se mueven en direccin contraria tienen que hacer frente a este flujo de
iones positivos hidratados, cuando la carga neta de las mismas es pequea pueden quedar inmviles e
incluso ir hacia el polo opuesto.
ACETATO DE CELULOSA
ELECTROFORESIS EN
Su aplicacin principal es separar las protenas del suero,
llamado PROTEINOGRAMA.
Se usa en anlisis de fluidos biolgicos.
Tiempo de anlisis corto.
Sencillez de la tcnica.
Respecto al papel , las membranas de acetato de celulosa tienen las ventajas de ser qumicamente
mas homogneas y poder transparentarse, por lo que, una vez teidas o reveladas las sustancias que
se separan, podrn cuantificarse por densitometra y transparencia.
Este tipo de membranas se utilizan mucho en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y la
rapidez de sus separaciones electroforticas.
Las tiras de acetato de celulosa se colocan en la cmara entre
dos compartimientos que contienen los electrodos , que estn
sumergidos en el mismo amortiguador. El amortiguador mas
utilizado es el veronal de pH 8,6. Como estas condiciones las
protenas tienen una carga neta negativa , el espcimen ha de
aplicarse en el extremo de la tira cercano al polo negativo, ya
que aquellas migraran al polo positivo. .
Se conecta la fuente de alimentacin y se aplican unos 2,5mA
por tira. Las protenas se separan en 25 min.
Una vez separadas, las
protenas se localizan en las
tiras de acetato de celulosa
por medio de diversos
colorantes, los mas
habituales son el rojo
ponceau y el negro amido.
La electroforesis en acetato de celulosa separa las protenas del suero en cinco fracciones, que
son la albmina y las globulinas
Valores de referencia Valores de
Fracciones
% referencia g/dl
Albmina 48,4 66,1 3,39-4,63
Alfa 1 2,6 6,3 0,18 0,44
Alfa 2 7,1 13,6 0,50 0.95
Beta 7,5 14,3 0,52 1,00
Gama 8,7 23,7 0,61 1,66
ELECTROFORESIS EN
GEL
Los geles de agarosa, almidn y poliacrilamida no son solo soportes que evitan
la difusin , pues, modificando la concentracin de los componentes que
forman el gel, pueden conseguirse diferentes porosidades y la separacin,
adems de por diferencias de carga, se produce tambin por diferencias de
tamao.
GEL DE AGAROSA
La electroforesis en gel de Agarosa produce buenas
resoluciones en periodos de tiempo cortos. Adems,
como la agarosa es transparente, se puede medir la
intensidad de las fracciones separadas por densitometra.
Normalmente, la agarosa se emplea con concentraciones
entre el 1 y el 3%. Los geles de este polisacrido se
forman suspendindolo en un amortiguador.
Despus se hierve la mezcla hasta que se forme una
disolucin clara, se vierte en el molde y se deja enfriar a
temperatura ambiente para formar un gel rgido.
Los geles de agarosa se emplean para la electroforesis de
protenas y cidos nucleicos.
GEL DE ALMIDN
El almidn para la electroforesis en gel debe estar
parcialmente hidrolizado, ya que el almidn nativo no forma
geles.
El poro del gel puede variarse hasta lograr el tamao
adecuado modificando la concentracin de almidn.
El principal problema de los geles de almidn es que su
preparacin es engorrosa.
GEL DE POLIACRILAMIDA
Los geles de poliacrilamida se
forman por polimerizacin de la
acrilamida por accin de un agente
entrecuzador, es qumicamente
inerte, de propiedades uniformes,
capaz de ser preparado de forma
rpida y reproducible. Forma,
adems, geles transparentes con
estabilidad mecnica, insolubles en
agua, relativamente no inicos y que
permiten buena visualizacin de las
bandas durante un tiempo
prolongado. Adems tiene la ventaja
de que variando la concentracin de
polmeros, se puede modificar de
manera controlada en el tamao del
poro, lamentablemente cada vez se
emplea menos en diagnostico debido
a su neurotoxocidad.
La electroforesis capilar es una tcnica en
ELECTROFORESIS
la que la electroforesis de zona en
capilares de 75um de dimetro interno y
25 cm de longitud. El tubo capilar se
conecta a un detector en un extremo, y a
una fuente de corriente a travs de
CAPILAR
recipientes con un amortiguador.
Ventajas:
Tienen un dimetro tan pequeo
que se logra una mayor
disipacin del calor, un menor
La gran disipacin del calor permite aplicar grandes volumen del espcimen y una
voltajes, de unos 5.000 V, que mejoran la eficacia anchura menor de las zonas de
de la separacin y reducen el tiempo de esta. separacin.
BIBLIOGRAFA
CONSULTADA
Jhonas Vega, 2013, recuperado de sitio web: [Link]
lquida-de-alta-resolucin-2
Juan Ramos; 2011, recuperado de sitio web [Link]
lquida-de-alta-presin?next_slideshow=1
Castillo Alejandra; Castro Fernando, 2014, recuperado de sitio web:
[Link]
Wikipedia. 12 de abril de 2016. recuperado de: [Link]
Jos Manuel Gonzlez de Buitrago. (2010). electroforesis en acetato de celulosa. Espaa.
elsevier masson.
Jos Manuel Gonzlez de Buitrago. (2010). electroforesis capilar. Espaa. elsevier masson.
