TEMA 11.

PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS

HIPÓTESIS GENERALES SOBRE EL PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS

1.La información para el plegado proteico está codificada en la secuencia.

Toda la información necesaria para que una proteína se pliegue está contenida en su estructura
primaria. Se conocen proteínas que desempeñan la misma función en organismos diferentes que
difieren en su estructura primaria en más del 50% pese a que tienen estructuras tridimensionales
iguales. Se desconoce la regla para identificar los aas esenciales para el plegamiento de las
proteínas. Hay aas que se han mantenido invariables a lo largo de la evolución, mientras que hay
otros que no influyen en la conformación proteica.

2.El plegamiento de proteínas no transcurre mediante una búsqueda al azar

En las células vivas, las proteínas se forman a partir de los aminoácidos a gran velocidad. Por
ejemplo, las células de E. coli pueden producir una molécula de proteína entera y biológicamente
activa de 100 residuos en aprox. 5 segundos.

¿Cómo alcanza la cadena polipeptídica su conformación nativa?

Vamos a suponer, en un cálculo a la baja, que casa residuo de aminoácido puede adoptar una
media de 10 conformaciones diferentes, lo que origina 10100 conformaciones diferentes del
polipéptido. Supongamos también que la proteína se pliega espontáneamente mediante un
proceso al azar en el que ensaya todas las conformaciones posibles en torno de cada enlace
sencillo de su esqueleto peptídico hasta encontrar su forma nativa biológicamente activa. Si cada
conformación se ensayara en el período de tiempo más corto posible (10 -13 s, o sea el tiempo
requerido para una sola vibración molecular), probar todas las conformaciones posibles
requeriría unos 1077 años. Por tanto, el plegamiento de proteínas no puede ser un proceso
completamente al azar en el que se siga el método de ensayo y error. A menudo se denomina la
paradoja de Levinthal. Las proteínas se pliegan en 10-1 o 10-13 segundos.

3.Experimento de Anfinsen.

La ribonucleasa A se desnaturaliza completamente mediante exposición a una disolución

concentrada de urea en presencia de un agente reductor (como por ejemplo β-mercaptoetanol).
El agente reductor rompe los cuatro puentes
disulfuro dando lugar a ocho residuos de Cys
y la urea 8 M elimina las intervenciones
hidrofóbicas estabilizantes, con lo que el
polipéptido pierde su conformación plegada.
Si elimino el exceso de agente reductor y
añado pequeñas trazas de oxígeno,
espontáneamente, los puentes disulfuro se
convierten en la proteína oxidada.

Manteniendo la concentración de urea y

eliminando el agente reductor, las trazas de
oxigeno permiten la formación de los cuatro
puentes disulfuro. Luego se elimina la urea.
El replegamiento de la proteína es tan preciso que los cuatro puentes disulfuro intracatenarios se
forman en las mismas posiciones originales observadas en la ribonucleasa nativa.

Cálculos matemáticos demuestran que las ocho Cys

podrían haberse recombinado al azar para formar
cuatro puentes disulfuro de 105 maneras diferentes,
dando lugar a una RNasa revuelta con tan solo un 1% de
actividad respecto a la proteína nativa. Se deduce, por
tanto, que los puentes disulfuro se forman después del
plegamiento de la proteína.

El experimento de Anfinsen demostró por primera vez

que la secuencia de aminoácidos de una cadena
polipeptídica contiene toda la información necesaria
para el plegamiento de la cadena en su estructura
tridimensional nativa.

LA CONFORMACIÓN NATIVA DEBE ESTAR EN UN MÍNIMO DE ENERGÍA LIBRE

El proceso de plegamiento se puede imaginar, termodinámicamente, como una especie de
embudo de energía libre. Los estados no plegados se caracterizan por un elevado grado de
entropía conformacional y una energía libre elevada. A medida que el plegamiento avanza, el
estrechamiento del embudo representa una disminución en el número de especies
conformacionales presentes. Las pequeñas depresiones a lo largo de las caras del embudo
representan intermediarios semiestables que pueden enlentecer el proceso de plegamiento. El
conjunto de intermediarios del plegamiento se reduce, en el fondo del embudo, a una única
conformación nativa.

En la parte superior, el número de

conformaciones y, por tanto, la
entropía conformacional es
grande. A medida que el
plegamiento avanza, la ruta
termodinámica hacia la parte
inferior del embudo reduce el
número de estados presentes,
aumenta la cantidad de proteína
en la conformación nativa y
disminuye la energía libre.
EL PLEGADO DE PROTEÍNA IN VIVO ESTÁ CATALIZADO POR ISOMERASAS Y CHAPERONAS
La ruta de plegamiento de muchas proteínas necesita dos enzimas que catalizan reacciones de
isomerización.

La proteína disulfuro isomerasa (PDI) es una enzima ampliamente distribuida que cataliza el
intercambio o la mezcla de enlaces disulfuro hasta que se forman los enlaces de la conformación
nativa. Tiene dos residuos de cisteína muy activos. El pK de la cisteína es muy bajo, por lo que
tiene tendencia a soltar el protón y atacar al puente disulfuro de la proteína que se está plegando.
Entre sus funciones, la PDI cataliza la eliminación de los intermedios de plegamiento con
entrecruzamientos de disulfuros inapropiados.

La proteína con los puentes

incorrectos se une a la PDI, y
rompe el puente disulfuro,
formando un puente mixto
con el residuo uno. La
cisteína 2 libre ataca al
puente entre 3 y 4 y se forma
el puente entre 2 y 3,
quedando 4 libre. Va
cambiando la conformación
de la proteína. Se forma el
puente entre 4 y 1.

La péptido prolil cis-trans isomerasa (PPI) cataliza la interconversión entre los isómeros cis y trans
de los enlaces peptídicos de prolina, que puede ser una etapa lenta del proceso de plegamiento
de proteínas que contienen algunos enlaces peptídicos de la prolina en la conformación cis.

Casi todos los enlaces son trans en lugar de cis. Sin embargo, hay una excepción en los enlaces X-
prolina. Para que la PPI pueda trasformar el 6% de los enlaces trans en cis es necesario que exista
libre rotación. Cuando la PPI se une al enlace trans, provoca una distorsión, de manera que los
carbonos dejan de ser planares y se pierde la hibridación, por lo que no presenta ya la estabilidad
adicional de la resonancia. El enlace C-N presenta ahora un carácter mayor de enlace sencillo, por
lo que la rotación es libre.
Para el plegamiento de muchas proteínas es necesaria la acción de las chaperonas moleculares,
proteínas que interaccionan con polipéptidos parcial o incorrectamente plegados, facilitando
rutas de plegamiento correctas. Se conocen dos clases de chaperonas moleculares. Ambas se
localizan en organismos que van de bacterias a humanos. La primera clase, una familia de
proteínas denominada Hsp70, presentan generalmente una masa molecular cercana a 70.000 y
son mas abundantes en células sometidas a estrés por temperaturas elevadas (de ahí proteínas
de choque térmico, heat shock proteins). Las Hsp70 se unen a regiones ricas en residuos
hidrofóbicos de polipéptidos no plegados, evitando la agregación inapropiada. Las proteínas
Hsp70 también bloquean el plegamiento de determinadas proteínas que deben permanecer
desplegadas hasta que hayan sido translocadas a través de la membrana.

Las proteínas Hsp70 se unen a

polipéptidos y los liberan en un
ciclo que usa la energía del ATP y
en el que también intervienen
otras proteínas (incluidas las de
una clase llamada Hsp40). Las
chaperonas DnaK y DnaJ de E. coli
son homólogas de las Hsp70 y
Hsp40 de eucariotas. Las proteínas
DnaK y DnaJ se identificaron en un
principio como proteínas
necesarias para la replicación in
vitro de ciertas moléculas de DNA vírico (de aquí la designación de “Dna”).

La segunda clase de chaperonas se denominan chaperoninas. Éstas son elaborados complejos

proteicos necesarios para el plegamiento de muchas proteínas celulares que no se pliegan
espontáneamente. En condiciones normales, se estima que entre un 10 y un 15% de proteínas
celulares de E. coli necesitan el sistema propio de chaperonina, denominado GroEL/GroES, para
plegarse. Las chaperorinas se descubrieron cuando se observó que eran necesarias para el
crecimiento de ciertos virus bacterianos (de aquí la designación “Gro”).

RUTA CÍCLICA POR LA CUAL LAS CHAPERONAS SE UNEN Y SE LIBERAN DE LOS POLIPÉPTIDOS
1.DnaJ se une a la proteína desplegada o
parcialmente plegada y después a DnaK.

2.DnaJ induce a la hidrólisis de ATP por la DnaK.

Dnak-ADP se unen firmemente a la proteína
desplegada, ya que DnaK unido a ADP presenta
más afinidad por la proteína desplegada.

3.El factor intercambiador de nucleótidos GrpE

que induce la liberación de ADP y DnaJ en
bacterias.

4.El DnaK vuelve a unir dos moléculas de ATP,

disminuye la afinidad de DnaK por la y la proteína
se disocia. Puede ocurrir que la proteína ya esté
plegada y no sean necesarias las chaperoninas o puede ocurrir que esté parcialmente plegadas y
que sí sea necesario que intervenga GroEL/GroES.

COMPLEJO GroEL/GroES
GroEl es un miembro de la familia de proteínas Hsp60. Cada
complejo GroEL está formado por dos bolsas grandes formadas
por dos anillos heptaméricos (cada subunidad tiene un Mr
57.000). cada subunidad tiene dos dominios principales, uno en
contacto con el anillo heptamérico contrario, y el otro al final de
la molécula de proteína cilíndrica.

GroES, es también un heptámero (subunidades de Mr 10.000) y

bloquea una de las bolsas de GroEL. Hay un gran espacio interior
en el que se pueden unir otras proteínas.