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ACIDOS NUCLEICO.

Molécula fundamental de a vida, todos los organismos la tienen (ADN-ARN). Los ácidos nucleicos son
moléculas muy grandes constituidas por la polimerización de nucleótidos. En los ácidos nuclecos se guarda la
información genética o genoma. Existen dos tipos de ácidos nucleicos: ADN y ARN. El ADN guarda la información
genética en todos los organismos celulares, el ARN es necesario para que se exprese la información contenida en
el ADN.
ARN: Ribonucleotido. Grupo fosfato unido al carbono 5´ de una pentosa que en su carbono 2´ tiene
unido un alcohol (OH) y unido a un carbono 1´ lleva unida una base nitrogenada (purina-pirimida).
ADN: Desoxiribonicleotido. El grupo fosfato unido al carbono 5´de una pentosa, que en su carbono
2´tiene un hidrogeno y unido a su carbono 1´tiene una base nitrogenada (purina- pirimida).
El ADN es el portador de la información genética y a través de ella puede controlar, en forma indirecta,
todas las funciones celulares. Encontramos ADN en el núcleo de las células animales y vegetales, en los
organismos procariontes, en organoides como los cloroplastos y mitocondrias, como así también en algunos virus,
a los que llamamos ADN - virus.

CADENAS POLINUCLEOTIDICAS.

Para formar estas cadenas, lo nucleótidos tienen que unirse unos a otros, dicha unión se produce entre
el grupo fosfato de un nucleótido al grupo hidroxilo de la penstosa de otro nucleótido. La unión libera una
molécula de H2O. La unión es un enlace fosfodiéster. El carbono 5´se une al grupo fosfato y este se une al carbono
3. Esta rección/unión va a dar la ruptura de ADN.

DOBLE HELICE.

El modelo de la doble hélice establece que las bases


nitrogenadas de las cadenas se enfrentan y establecen entre ellas uniones
del tipo puente de hidrógeno. Este enfrentamiento se realiza siempre entre
una base púrica con una pirimídica, lo que permite el mantenimiento de la
distancia entre las dos hebras. La Adenina se une con la timina formando
dos puentes de hidrógeno y la citosina con la guanina a través de tres
puentes de hidrógeno. Las hebras son antiparalelas, pues una de ellas tiene
sentido 5’ ® 3’, y la otra sentido 3’ ® 5’. Se describe a la molécula del ADN

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como una doble hélice, enrollada sobre un eje, como si fuera una escalera de caracol y cada diez pares de
nucleótidos alcanzan para dar un giro completo. Excepto en algunos virus, el ADN siempre forma una cadena
doble.

REGLAS DE CHARGRAFF.

La ley de Chargaff se basa en la relación cuantitativa de los nucleótidos que forman la doble hélice del
ácido desoxirribonucleico (ADN).

 La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = T. La relación entre Adenina y Timina es igual
a la unidad (A/T = 1).
 La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La relación entre Guanina y Citosina es
igual a la unidad (G/C=1).
 La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C). La
relación entre (A+G) y (T+C) es igual a la unidad (A+G) /(T+C) =1.
Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) era característica de cada organismo, pudiendo tomar
por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos no eran
la repetición monótona de un tetranucleótido. Existía variabilidad en la composición de bases nitrogenadas.
Las reglas de Chargaff solo se aplican a la molécula de ADN y no al ARN, porque este último está
formado por una secuencia lineal o de hélice simple de nucleótidos y por no poseer timina; en su lugar tiene
uracilo (U).

ARN. Acido Ribonucleico.

Cadena simple, se pliega para minimizar la repulsión. La cadena tiene una parte hidrofílica
(compatibilidad con H2O) y una parte hidrofóbica (que repele el agua).

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TIPOS DE ARN:

ARN Ribosomal: Este tipo de ARN una vez transcripto,


pasa al nucleolo donde se une a proteínas. De esta manera se
forman las subunidades de los ribosomas. Aproximadamente dos
terceras partes de los ribosomas corresponde a sus ARNr.
ARN Mensajero: Lleva la información sobre la
secuencia de aminoácidos de la proteína desde el ADN, lugar en
que está inscrita, hasta el ribosoma, lugar en que se sintetizan las
proteínas de la célula. Es, por tanto, una molécula intermediaria
entre el ADN y la proteína. En eucariotas, el ARNm se sintetiza en
el núcleo de una célula y de allí accede al citoplasma, donde se
hallan los ribosomas. Tienen segmentos que son cortados y se llaman intrones, que antes se creía que se
desechaban, pero no.
ARN Transferencia: Son cortos polímeros de unos 80 nucleótidos que transfiere un aminoácido
específico al polipéptido en crecimiento; se unen a lugares específicos del ribosoma durante la traducción. Su
función básicamente es conjuntamente con el ADN, sintetizar proteínas.
MICRO ARN: Señalizan en el ADN el inicio de transcripción, tienen función de mediadores de
transcripción.

DOGMA CENRAL DE LA BIOLOGIA.

El primer dogma central de la biología molecular planteaba que el ADN se replicaba, se transcribía en
ARN para luego convertirse en proteína. Pero el nuevo dogma central de la biología molecular plantea que el ARN
también se replica y tenemos una transcripción inversa (Ej: Retrovirus).

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REPLICACION.

Mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). Reproducción de un
virus u organismo. Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un mecanismo
semiconservador, lo que indica que los dos polímeros complementarios del ADN original, al separarse, sirven de
molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada
nueva doble hélice contiene una de las cadenas del ADN original. La molécula de ADN se abre como una
cremallera, por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias en puntos determinados.
Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de
otras proteínas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicación.
Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el
llamado complejo de replicación
Síntesis de una nueva macromolécula copiando una similar (complementaria) como molde. Replican
todos aquellos organismos vivos que tienen esa molécula.
REACCION DE POLIMERIZACION: Enlace fosfo-diester.

REPLICACIÓN IN VITRO. Arthur Kornberg.

ADN: Molde de Doble Cadena. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran
cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar en estado
de hélice sencilla.
DNTPS: Nucleotidos Trifosfatos (TODOS). (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el
primers, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato en cada reacción.
DNA Enzima Polimerasa: Encima que polimeriza dependiente de ADN: emplea como molde ADN de hélice sencilla
y siguiendo las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un
"primers".

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Primers: “No iniciador”, secuencia chica de ARN. Suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de
longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este primers
debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar
MG+2: Magnesio.
Para poder sintetizar AND la doble hélice se a abrir y va a dar una horquilla de replicación.
Vamos a observar en la horquilla de replicación dos cadenas, una se llama cadena retrasada y la otra
cadena adelantada. El motivo de los nombres es porque la cadena retrasada con orientación 5´ 3´tiene que
esperar un tiempo hasta que llegue el primers, para que luego la polimerasa comience su trabajo. La polimerasa
va a leer la cadena de 3´a 5´y va a pegar de 5´a 3´. No importa la ubicación, siempre la polimerasa lee y pega de
esta manera.

ENZIMAS QUE PARTICIPAN EN LA REPLICACION.

En la horquilla hay proteínas estabilizan la hélice y evitan que se pegue algo que no participa en la
replicación.
HELICASA: Es la enzima encargada de separar la hélice, como si fuera una tijera. Rompe los puentes de hidrogeno
entre las bases complementarias de ambas cadenas de nucleótidos y abre la doble hélice como una cremallera.
POLIMERASA: Enzima que polimeriza la cadena. No va a buscar nada, los nucleótidos llegan. Lo que hace la
polimerasa es pegar y correrse, cuando una base no es compatible, la polimerasa se corre, viene una subunidad
de polimerasa, analiza la base que se pego y si es una base errónea la corta y pega la base correspondiente. Esto
es a prueba y error.
TOPOISOMERASA: Enzima que se ocupa del superenrrollamiento. Corta por encima del grupo fosfato para
desenrollar, una vez desenrollada la cadena, esta enzima vuelve a unir lo que corto.

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RNA PRIMASA: Enzima del Primer, que va a ir donde está ubicado el primer de la cadena y reemplaza el RNA por
DNA.
LIGASA: Enzima que liga con gasto de ATP, rompe la unión trifofato de ATP y forma [AMP+2PI].
SSB: Proteínas que estabilizan las cadenas abiertas y las mantienen separadas una de otra.
PRIMER: Fragmentos de ARN que se unen a la cadena molde por puentes de hidrógeno para que el ADN
polimerasa III reconozca donde debe unirse para empezar a añadir nucleótidos.
EL ADN POLIMERASA I: Reemplaza los cebadores de ARN por nucleótidos de ADN.
EL ADN POLIMERASA II: Interviene en la corrección de errores.
EL ADN POLIMERASA III: Sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de
forma discontinua en la hebra rezagada, ya que solo puede sintetizar en dirección 3'→ 5'.

TELOMERASA:Hace telomeros, también pega de tres a cinco. Se encarga de hacer moldes, desde que esta el
embrión la telomerasa esta lista para hacer moldes. Cuando tengo una cadena corta la polimerasa no se puede
correr, porque no tiene lugar, ni tampoco
polimeriza. Entonces el telomero llega con el
molde, lo pone en el lugar que corresponde y
ahí la polimerasa lo pega.

Células que tiene telomerasa: Embrionarias


tempranas, células madres derivadas de
embriones (células pluripotentes) o las
presentes en tejidos diferenciados, germinales
(precursoras de gametas), en situaciones
patológicas, en líneas celulares.

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Subunidad de polimerasa. (E)
Se encarga de analizar y quitar aquellas
bases que no correspondan y pegar las que
si para que la polimerasa siga su función.

-PCR. KARY MULLIS.

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR. Desarrollada en 1983 por Kary Mullis.Su
objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en
teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un
fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer
investigación científica sobre el ADN amplificado.
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de
ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN
recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a
unirse para poder duplicarlas nuevamente.
Voy a crear el primer que yo quiero, de acuerdo a lo que yo quiera para empezar la amplificación. Esto
parte (dibujo) de una doble hélice que se calienta y se separa. Entonces, caliento la doble hélice, se separa. Agrego
el primer y vuelvo a calentar, alargando de esta manera el gen de interés, asi a medida que se sigue calentando se
amplifica mas el gen de interés.
3´ 5´ Necesito: Primers, nucleótidos, polimerasa (TAQ) que es
resistente al calor, temperatura.
5´ 3´

Primer: Necesitamos dos, cada uno complementarios a una de las dos hebras del ADN. Permiten que la
polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y no a mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a
amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP): Sustratos para polimerizar nuevo ADN.
Iones divalentes: Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o
algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante
PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como
cofactores de la polimerasa.

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Iones monovalentes: Como el potasio.
Solución tampón o buffer: que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa: O mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es
la polimerasa Taq).
ADN molde: Que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
Termociclador: El aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un
ciclo.

PROCESO:

Inicio: Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está
usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario
para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Desnaturalización: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales
está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la
muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por
ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la cadena, como también del largo de la misma.
Alineamiento o unión del cebador: A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el
cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a
40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno
estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy
similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a
sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
Extensión o elongación de la cadena: Actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la
cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La
polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP
complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de
la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que
usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El
tiempo de extensión depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que
se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN
polimerizará mil bases en un minuto.
Elongación final: Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos
tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente
ampliado.
Conservación: Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para
conservar la reacción a corto plazo.

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Para una PCR con ARN, lo primero que tengo que hacer es una transcripción inversa, para obtener ADN y luego
comienzo el proceso de PCR de la misma manera.

NATURALEZA SEMI-CONSERVATIVA DE LA REPLICACION. MESELSON-STAHL.

La naturaleza semi-conservativa de replicación de DNA es universal. Procariotas, Eucariotas (hongos


plantas, vertebrados, invertebrados) Virus de DNA con su propia polimerasa de DNA
Método: Para este experimento, los científicos Matthew Meselson y Franklin W. Stahl utilizaron la
bacteria E. coli. También utilizaron el isotopo del nitrógeno N15. El nitrógeno es uno de los elementos
fundamentales del DNA y mientras que este isotopo no es radioactivo, es más pesado.
Desarrollo: En primer lugar, extrajeron el DNA de bacterias criadas en un medio normal con tal de
obtener mediante una centrifugación con un gradiente de cloruro de cesio (CsCl) la densidad del DNA de dicha
bacteria. Después, dejaron crecer las bacterias en un
medio con N15 y volvieron a extraer el DNA y lo
centrifugaron para obtener su densidad, que
lógicamente era mayor que la del DNA extraído de las
bacterias en un medio de N14.
Seguidamente, dichas bacterias cultivadas con el
isotopo pesado del nitrógeno fueron cambiadas a un
medio de N14 y se les dio el tiempo justo para que
solo pudiesen replicarse una única vez. Se volvió a
extraer el DNA y se centrifugó. Esta vez, la banda que
apareció no se correspondía con ninguna de las
anteriores mediciones, si no que era un punto
intermedio. Este hecho permitió descartar la teoría
conservativa, ya que según los supuestos de esta
teoría se habrían obtenido dos bandas: una
correspondiente a la densidad del DNA materno (banda de N14) y otra que se emparejaría con las bacterias
cultivadas en un medio con N15. Con tal de descartar una de las dos últimas teorías restantes, se extrajo el DNA
de bacterias que también habían crecido durante varias generaciones en un medio de N15 pero que habían tenido
ocasión de replicarse dos veces en un medio con N14. Al centrifugar este DNA se observaron dos bandas: una que

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se correspondía con la medición de las bacterias que solo se habían replicado una vez y la otra que equivalía al
DNA creado únicamente a partir de N14. Este resultado fue definitivo, puesto que siguiendo los principios de la
teoría dispersa no debería haber aparecido una segunda banda, puesto que todas las cadenas de DNA tendrían,
en mayor o menor medida, fragmentos del DNA original.
Conclusión: Gracias a este experimento se demostró que la teoría de replicación semiconservativa del
DNA propuesta por Watson y Crick era correcta.

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