TEMA 13.

NATURALEZA POLIMÉRICA DE LOS ÁCIDOS

NUCLEICOS

Los nucleótidos son los constituyentes básicos de los ácidos

nucleicos. Los nucleótidos están formados por tres
componentes característicos: (1) una base nitrogenada, (2) una
pentosa y (3) un fosfato. La molécula sin el grupo fosfato de
denomina nucleósido. Las bases nitrogenadas son derivados de
dos compuestos parentales, pirimidina y purina. Las bases y las
pentosas de los nucleótidos comunes son compuestos
heterocíclicos.

CONVENCIÓN CLAVE

A los átomos de carbono de las pentosas de los nucleótidos y nucleósidos se les añade el
signo prima (´) para distinguirlos de los átomos numerados de las bases nitrogenadas.

La base de un nucleótido está unida

covalentemente (por el N-1 en las
pirimidinas y el N-9 en las purinas) a
través de un enlace N-𝜷-glucosídico
con el carbono 1´ de la pentosa, y el
fosfato está esterificado generalmente
con el carbono 5´. El enlace N-β-
glucosídico se forma por eliminación de
agua (un grupo hidroxilo de la pentosa
y un hidrógeno de la base).

Las células también contienen nucleótidos con grupos fosfato en posiciones diferentes
del carbono 5´. Algunos ejemplos son la adenosina 3´,5´-monofosfato cíclico (cAMP) y la
guanosina 3´,5´-monofosfato cíclico (cGMP).
Tanto el DNA como el RNA contienen dos bases purínicas principales, la adenina (A) y la
guanina (G), y dos pirimidinas principales. Tanto en el DNA como en el RNA una de las
pirimidinas es la citosina (C) pero la segunda base pirimidínica no es la misma en los dos,
es la timina (T) en el DNA y uracilo (U) en el RNA.

Adenina: 6-amino-purina
Guanina: 2-amino-6-oxo-
purina
Citosina: 2-oxo-4-amino
pirimidina
Uracilo: 2,4-dioxo- pirimidina
Timina: 2,4-dioxo-5-metil-
pirimidina

PROPIEDADES DE LAS BASES NITROGENADAS

▪ Aromaticidad
▪ Planares
▪ No ionizadas a pH fisiológico, compuestos básicos débiles
▪ Relativamente insolubles en agua (no son polares)
▪ Formas tautómeras (amino-imino, lactama-lactima)
▪ Formación de enlaces de hidrógeno
▪ Absorben luz en el UV, 260 nm

FORMAS TAUTÓMERICAS

Formas tautoméricas del uracilo. A pH 7

predomina la forma lactama, la otra adquiere
más importancia al disminuir el pH.
 Se interconvierte un amino (-NH2) en un
imino (=NH) cerca de un N cíclico. La forma
imina es más inestable.

TIPOS DE PENTOSAS
Los ácidos nucleicos contienen dos tipos
de pentosas. Los desoxirribonucleótidos
del DNA contienen 2´-desoxi-D-ribosa, y
los ribonucleótidos del RNA contienen D-
ribosa. El anillo de la pentosa no es plano.
En los desoxirribonucleótidos un -H
reemplaza al grupo -OH del carbono 2´.

La ausencia de grupo -OH en los desoxirribonucleótidos hace que el DNA sea

químicamente menos reactivo que el RNA. Por ejemplo, el DNA es estable en una
solución alcalina mientras que los enlaces fosfodiéster del RNA se hidrolizan debido a la
mayor reactividad. Esta mayor reactividad también tiene que ver con el hecho de que el
RNA tenga afinidad catalítica, mientras que el DNA tiene como función almacenar y
transmitir información genética.
La función catalítica de los RNA hace pensar que inicialmente existía un mundo RNA
donde el RNA hacía las funciones de catalizador y de almacenamiento de la información
biológica. Cuando aparecieron las proteínas, desplazaron al RNA de esa tarea, al
presentar mayor versatilidad. Por otro lado, el DNA sustituyó al RNA como almacén de
la información genética.

NOMENCLATURA DE DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS
NOMENCLATURA DE RIBONUCLEÓTIDOS

PROPIEDADES DE LOS NUCLEÓTIDOS

✓ Constituyen la moneda energética (ATP) en las transacciones metabólicas en los
seres vivos.
✓ Puede haber derivados cíclicos, en los que el éster fosfórico está formando un
éster cíclico con dos hidroxilo. Funcionan como reguladores metabólicos y
median la acción de muchas hormonas: cAMP y cGMP
✓ Son componentes estructurales de una serie de cofactores enzimáticos e
intermedios metabólicos: NAD+, FAD y CoA.
✓ Son los constituyentes de los ácidos nucleicos: DNA (ácido desoxirribonucleico)
y RNA (ácido ribonucleico).
✓ Derivados de nucleótidos son intermediarios claves en biosíntesis, ya que los
azúcares (al no ser particularmente reactivos para las reacciones) tienen que
activarse al unirse a un nucleótido mediante un enlace covalente, y así llevar a
cabo reacciones de polimerización: UDP-GLC (biosíntesis de glucógeno) y CDP-
DIACILGLICEROL (biosíntesis de fosfoglicéridos).
✓ Análogos se emplean en farmacología.
✓ Absorben luz en el UV, 260 nm, debido a
los dobles enlaces conjugados de las bases
nitrogenadas.
Los espectros de absorción muestran la
variación del coeficiente de absorción
molar con la longitud de onda.
POLINUCLEÓTIDOS
Los nucleótidos sucesivos del DNA y el RNA están unidos
covalentemente mediante “puentes” de grupos fosfato,
en los cuales el grupo hidroxilo en 5´de un nucleótido
está unido al grupo hidroxilo en 3´del nucleótido
siguiente mediante un enlace fosfodiéster. Los grupos
fosfato se encuentran completamente ionizados y
cargados negativamente.
Todos los enlaces fosfodiéster en el DNA y en el RNA
tienen la misma orientación a lo largo de la cadena, con
lo cual cada cadena lineal de ácido nucleico tiene una
polaridad específica y extremos 5´y 3´diferenciados. Por
definición, el extremo 5´carecede nucleótido en posición
5´, mientras que el extremo 3´carece de nucleótido en
posición 3´.
Se dice que la cadena es direccional, y la cadena de
avance se define como 5´-3´.
Las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos pueden representarse
esquemáticamente, tal como se ilustra a continuación para un segmento de DNA de tres
nucleótidos. Los grupos fosfato se representan con el símbolo P, y cada una de las
desoxirribosas mediante una línea vertical que va del C-1´en la parte superior de la línea
vertical al C´5 en la inferior. Las líneas
que conectan nucleótidos se dibujan
uniendo en diagonal el punto medio (C-
3´) de la desoxirribosa de un nucleótido
con el extremo inferior (C-5´) del
siguiente.
Otras representaciones de estos tres
nucleótidos son pA-C-GOH, pApCpG.

SECUENCIACIÓN
La secuenciación del RNA, que por razones técnicas es más sencilla de llevar a cabo que
la del DNA, se desarrolló con anterioridad a la del DNA. El primer nucleótido se secuenció
en 1965.
Antes de 1975, los RNA se secuenciaban mediante difusión parcial de nucleasas y
fosfodiesterasas. Se trataban con ribonucleasa A del páncreas, que rompe e hidroliza
enlaces fosfodiéster detrás de las pirimidinas. También se utilizaba la ribonucleasa T1
que rompe detrás de residuos de guanina.
 Ejemplos de exonucleasas: fosfodiesterasa de veneno de serpiente (va separando uno a
uno ribonucleótido desde el extremo 3´.
Fosfodiesterasa del bazo: separa desde el extremo 5´.
Se descubren las endonucleasas de restricción, y dentro de ella, las de tipo 2 que
hidrolizan los enlaces fosfodiéster solo si obedecen a secuencias palindrómicas. EndoR1
es una endonucleasa de restricción que reconoce la secuencia GAATTC.

SECUENCIACIÓN DEL DNA POR EL MÉTODO DE SANGER

La propiedad más importante del DNA como depositario de la información genética es
su secuencia de nucleótidos. Se basa en métodos electroforéticos que permiten la
separación de hebras de DNA que difieren en tamaño en un solo nucleótido.
Frecuentemente se utiliza poliacrilamida como matriz de los geles.
Este método utiliza el mecanismo de síntesis de DNA por las DNA polimerasas. Las DNA
polimerasas requieren a la vez un cebador al que se añaden los nucleótidos y una hebra
molde que dirige la selección de cada uno de los nuevos nucleótidos.
Este método utiliza también cuatro análogos del
tipo didesoxinucleósido trifosfato (ddNTP, uno de
ellos marcado con fósforo, aunque actualmente
es mejor utilizar métodos fríos) para interrumpir
la síntesis del DNA (también es conocido como el
método de los didesoxi). Cuando se inserta un
ddNTP en lugar de un dNTP se detiene la
elongación de la cadena a causa de la ausencia del
grupo hidroxilo en 3´en el análogo 2,3-didesoxi,
necesario para la siguiente reacción (por eso se llama replicación controlada).

MECANISMO CATALÍTICO DE POL1

La pol1 va en dirección 5-3.

El extremo 3´OH libre ataca (ataque nucleófilo) al fósforo alfa (el más cercano a la pentosa) para formar el
enlace fosfodiéster 3´-5´. La hidrólisis del pirofosfato es lo que da energía y hace que la reacción vaya hacia
la derecha. El ultimo nucleótido tienen que tener su extremo 3 rima libre para que pueda atacar. Si ahora
el nucleótido que entra es 2,3- didesoxi, el nucleótido anterior a este va a atacar al que se incorpora. Como
no tiene 3´OH no puede atacar al nucleótido posterio, por lo que la replicación se paraliza.
El DNA a secuenciar se utiliza como hebra molde y se hibrida con un cebador corto,
marcado con radiactividad o con
fluorescencia. Mediante la adición de
pequeñas cantidades de un único ddNTP,
por ejemplo ddCTP, las hebras sintetizadas
detendrán prematuramente su crecimiento
en las posiciones en las que normalmente
se encuentre dC. El resultado es una
disolución que contiene una mezcla de
fragmentos marcados acabados en un
residuo C. Cada residuo C en la secuencia
genera un conjunto de fragmentos de una
longitud determinada, de forma que el
tamaño de los fragmentos, separados por
electroforesis, indica la localización de los
residuos C en la secuencia. Este
procedimiento se repite separadamente
para cada uno de los cuatro ddNTP, y la
secuencia puede leerse directamente de un
autorradiografía del gel.
En el gel de electroforesis, los oligonucleótidos tienen que correr como hebras sencillas
para que se separen mejor, esto se consigue con urea 8M y a 70 oC para que se alcance
la temperatura de fusión y no hibride. El campo eléctrico presenta una gran intensidad.
Los fragmentos de DNA más cortos migran a mayor velocidad, de manera que los más
cercanos al extremo inferior del gel representan las posiciones de los nucleótidos más
cercanos al cebador (extremo 5´) y la secuencia se lee de abajo arriba (en la dirección
5´-3´). La secuencia obtenida corresponde a la hebra complementaria de aquella que
está siendo analizada.
Con este método se secuencia como mucho 660 a 1000 pares de bases.

AUTOMATIZACIÓN
La secuenciación de DNA se realiza actualmente de modo automático, mediante una
variante del método de Sanger, en la cual los didesoxinucleótidos utilizados en cada
reacción están marcados con fluoróforos que emiten luz de diferente color. Esta
tecnología permite obtener secuencias de miles de nucleótidos en unas pocas horas.
Todos los fragmentos de una longitud de onda determinada migran a través del gel del
capilar en un solo pico y el color asociado a cada uno de ellos se detecta utilizando un
rayo láser.
Este método aumenta la sensibilidad y elimina la radiactividad. Además, no hay que
separarlos en cuatro calles, ya que los cuatro ddNTP se añaden a un único tubo.
SECUENCIACIÓN DE DNA UTILIZANDO MICROARRAYS
Un microarray o ADN-chips consiste en una matriz de “pocillos” microminiaturizados
sobre un sustrato de vidrio donde se implantan cadenas simples de oligonucleótidos.
Si se pone el microarray en contacto con una mezcla de cadenas simples de ADN a
identificar, marcadas fluorescentemente, éstas se hibridarán con su oligo
complementario.

Dado que conocemos la secuencia y distribución de los oligonucleótidos en el microarray

podemos, al excitar el microarray con un láser y estar las cadenas hibridadas
fluorescentemente, conocer la ubicación de las cadenas de la mismas y su secuencia.