EJERCICIOS FLUORESCENCIA

1. Apórtense varios mecanismos posibles para que se produzca un incremento del

rendimiento cuántico de un compuesto fluorescente cuando éste está ligado a otra
sustancia.

2. Una proteína que contiene diez triptófanos presenta una fuerte fluorescencia debida a
dicho aminoácido. Una pequeña molécula que se liga fuertemente a la proteína no altera
en nada la fluorescencia de la misma al acoplarse a la proteína, incluso a pesar de que se
sabe que existen dos triptófanos en el lugar de enlace. Apórtense varias explicaciones a
esta observación.

3. ¿Qué efecto produce en el proceso de emisión fluorescente del BrEt su interacción con
DNA?

4. A mayor concentración de compuesto fluorescente en una solución mayor emisión de

fluorescencia obtendré. Razona la veracidad o falsedad de esta afirmación.

5. Analiza los espectros de la figura y obtén toda la información posible.

¿Qué representa? ¿Qué podrías decir tanto estructuralmente como espectroscópicamente
del compuesto M1? ¿Qué podrías decir tanto estructuralmente como
espectroscópicamente del compuesto M2? ¿Qué características espectrales tendría una
mezcla de ambos compuestos?, etc.

A I(F)

M1 M2

      
Valores crecientes de 
6. Localización de triptófanos en una proteína hipotética mediante técnicas de fluorescencia.
Nos disponemos a trabajar con un enzima que contiene 5 triptófanos y estamos interesados en
conocer la distribución estructural aproximada de los mismos.
Sabemos por estudios preliminares que el rendimiento cuántico () de emisión de fluorescencia
de los trp es mayor que el que se obtendría si todos ellos estuvieran en solución polar, luego
alguno de los trp debe encontrarse en regiones no polares. Proporciona una hipótesis sobre la
posible localización estructural de los triptófanos en el enzima a estudiar en base a los siguientes
experimentos:
1. Cuando se calienta la proteína desde 20ºC hasta 55ºC el descenso del  es de un 35%
del análogo para el trip libre.
2. Si añadimos una concentración elevada de ion I-, el 30% de la fluorescencia resulta
extinguida.
3. En ningún caso se extingue el 40%.
4. Añadimos un sustrato del enzima en cuestión y no se produce ningún cambio en el valor
del .
5. En presencia del sustrato, el I- extingue solamente el 15% de la fluorescencia.

7. Imagina que tienes una proteína marcada con dos fluoróforos, uno con una λex = 485 nm y
un máximo de emisión en λem = 528 nm y el otro con un máximo de emisión en λem =
581nm
Si realizas un experimento excitando la fluorescencia a 485 nm y detectando la emisión desde
515 nm hasta 640 nm, observas estos dos tipos de espectros dependiendo de la concentración de
Mg++ según las condiciones en las que realices el experimento (a baja concentración de
Magnesio, imagen izquierda; a alta concentración de Magnesio, imagen derecha).

Decides entonces realizar el experimento variando sistemáticamente la concentración de Mg++.

La representación de los datos que obtienes es la siguiente:
a) Explica los
resultados y la información cualitativa y
cuantitativa de los experimentos.
 a) ¿Qué diferencias experimentales cabría esperar si en lugar de estudiar la emisión de
fluorescencia estuvieras analizando la emisión de fosforescencia? Razona la respuesta.

8. Con el objetivo de estudiar el efecto a nivel celular de la picadura de abeja se realizó

el siguiente experimento:
1. Se introduce en vesículas unilamelares de ácido DMPA (simulando una membrana
biológica) una sonda fluorescente. Dicha sonda, difenilhexatrieno (DPH) es una
molécula que, dado su carácter hidrofóbico, es estable en el interior de las
vesículas y el rendimiento cuántico de su emisión de fluorescencia es muy elevado
en entornos hidrofóbicos disminuyendo al pasar a entornos polares.

2. Una solución de vesículas se divide en cinco alícuotas una de las cuales se utiliza
como control y las otras cuatro alícuotas se incuban con cantidades crecientes de
melitina (relación Lípidos/melitina: R1=64; R2=16; R3=8; R4=2)

Se sabe que la melitina es un polipéptido presente en el veneno de abejas que se inserta

en las membranas biológicas como resultado de la picadura del animal y eventualmente
produce lisis celular.

El estudio se completa incluyendo la variable de la temperatura en el efecto de lisis

celular producido por la presencia de melitina.

Los resultados obtenidos se muestran en la gráfica en la que se estudia la variación del

rendimiento de la emisión de fluorescencia de la sonda DPH con la temperatura para
para cada una de las alícuotas preparadas.

a) Dar una interpretación adecuada y razonada de los resultados.

b) Tras sufrir una picadura ¿qué recomendarías, aplicar frio o calor a la zona para
evitar la inflamación?