Biología Molecular 2

Cuestionario Unidad 1: Microscopía

Dra. Caroline Bacquet
Viernes 25 de octubre 2019

1. Se quiere observar una muestra de células en la cual se han marcado dos proteínas
utilizando fluoróforos distintos, uno que emite en el rojo (Rodamina-red, líneas azules) y
otro que emite en el verde (Alexa488, líneas verdes). Para observarlos, se utiliza un
microscopio con los cubos de fluorescencia que se detallan en la tabla adjunta. Determinar
si es posible hacer la observación de cada una de las proteínas por separado y, en caso
negativo, qué controles haría para solucionar el problema.

2. Se quiere determinar si dos proteínas A y B interactúan. Para ello, se marca la

proteína A con la sonda fluorescente FITC en una relación 1:1 (moles de sonda a moles de
proteína) y la proteína B con la sonda fluorescente ReAsH, también en relación 1:1.
Posteriormente se mezclan ambas proteínas marcadas hasta las concentraciones
indicadas en la siguiente tabla y se mide la fluorescencia de la muestra resultante
utilizando λex = 470 nm obteniéndose los siguientes resultados

a) Existe asociación entre ambas proteínas? Justificar explicando cualitativamente los

resultados obtenidos en la tabla.
 b) Que pasaría si a la muestra 4 le agrega proteína B sin marcar? Grafique
esquemáticamente los espectros de emisión obtenidos antes y después del agregado

3. La difusión lateral de una proteína de la membrana plasmática se ha estudiado

utilizando la técnica de recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueo (FRAP) en una
célula en condiciones normales, y se ha obtenido la siguiente gráfica. Bajo una condición diferente
(por ejemplo, cuando se activa una ruta de señalización), la proteína se une a algunas otras
proteínas y complejos proteicos en la membrana plasmática. Como resultado, su coeficiente de
difusión lateral se reduce y una fracción significativa de las moléculas de esta proteína se
inmoviliza en grandes agregados. ¿Cómo esperas que cambie la curva FRAP bajo estas nuevas
condiciones? La línea de puntos en cada gráfico es la curva original que se muestra para
comparar.
4. Tengo un microscopio fluorescente equipado con una lámpara de mercurio (ver espectro a
continuación).

También tengo los siguientes filtros para el microscopio:

¿Qué filtros debo usar como filtro de excitación y filtro de emisión para obtener imágenes de los
siguientes tintes (ver los espectros a continuación)
5. Haz logrado organizar unas moléculas fluorescentes (estrellas a continuación) en un patrón
nano que dice hola.

a) Dibuja la imagen de este patrón que obtendrás si usas un microscopio óptico estándar de
fluorescencia.
b) Dibuja las secuencias de imágenes que obtendrás si visualizas el patrón utilizando
STORM.
 c) Dibuja la secuencia de imágenes que obtendrás si visualizas el patrón mediante
microscopía STED.

6. Podemos investigar las relaciones entre diferentes proteínas en las células mediante imágenes
de estructuras marcadas con diferentes colores. Estas imágenes pueden luego ser analizadas
mediante un proceso llamado colocalización. Colocalización se refiere a la coincidencia de dos
píxeles de canales individuales en la misma ubicación en la imagen.

Una forma de determinar la colocalización es calcular la correlación entre dos conjuntos de píxeles
de la imagen.

Las siguientes imágenes (Figura 1) se tomaron de un experimento en el que se trató de dilucidar

el origen de las membranas que están involucradas en las partículas de encapsidacion viral. Con
este conocimiento, se podrían generar potenciales fármacos antivirales que inhiban este paso en
el ciclo de vida del virus.

Los investigadores plantearon la hipótesis de que el proceso celular involucrado en la autofagia

estaba siendo secuestrado por el virus para generar membranas necesarias para nuevas
partículas virales. Para investigar esto realizaron dos experimentos: uno en el que tiñeron células
con unanticuerpo contra LC3, una proteína que está asociada con el desarrollo del autofagosoma.
La segunda tinción se realizó con un anticuerpo contra la proteína de la cápside viral (Figura 1A).
En un segundo experimento, utilizaron un tinte fluorescente para teñir los cuerpos lipídicos y
conjuntamente se incubó la muestra con un anticuerpo contra LC3 (Figura 1D). Luego realizaron
análisis de imágenes para resaltar los píxeles que estaban colocalizados en las imágenes. Estos
son destacados en las imágenes de las Figuras 1B y 1E como píxeles blancos. Finalmente
determinaron la correlación entre las imágenes (Figura 1C y 1F). Dedujeron que a mayor número
de píxeles que se encontraban en las proximidades de la línea de tendencia en el diagrama de
correlación, más fuerte es la relación entre las dos proteínas de interés.

Figura 1: Obtención de imágenes de fluorescencia para dilucidar el origen de las membranas

involucradas en encapsidación de partículas de virus.
 I. De los diagramas de arriba. ¿Qué estructuras mostraron la mejor relación de
colocalización?

a) Virus y autofagasomas.
b) Autofagasomas y cuerpos lipídicos.
c) Ambos eran iguales
d) Ninguno se asocia significativamente.

II. ¿Qué podemos deducir de estos datos en cuanto al origen de las membranas que
forman los nuevos virus?

a) El ensamblaje del virus se produce en autofagosomas sin incorporación de cuerpos

lipídicos
b) El ensamblaje del virus se produce en autofagosomas e incorpora cuerpos lipídicos
c) El ensamblaje de virus utiliza lípidos celulares y no utiliza estructuras de autofagosomas
d) El ensamblaje de virus utiliza membranas derivadas de autofagosomas y puede contener
cuerpos lipídicos