9 DE JUNIO 2023, GENETICA MOLECULAR DE LEVADURAS

Problemas
backgrounds genéticos diferentes:

W303 MATa/MAT {leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15} [phi+]

BY4742 MAT his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0

BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0

1- La canavanina es un compuesto tóxico para la cepa BY4742 y también para la cepa BY4741.
Sin embargo, al contrario de lo que usted esperaba, la cepa W303 es resistente a este compuesto.
Al analizar el genotipo, usted ha notado que una de las cosas en las que difieren estas cepas es
en el locus del gen CAN1, un transportador de arginina. Sospecha, entonces, que este es el gen
involucrado en la resistencia (o susceptibilidad) a este compuesto. Para poner a prueba esta
hipótesis, decidió generar una mutante en CAN1 en el background genético BY4741. En el
laboratorio usted cuenta con el conjunto de plásmidos descriptos en el trabajo de Longtine y col
(Yeast 14, 953–961, 1998).
Describa los pasos que realizaría para obtener la mutante con la deleción del gen CAN1.
Incluya la secuencia de los primers que utilice. Describa la secuencia del locus de interés de
dicha cepa.

2- Se sabe que la proteína Pil1 es fundamental para la estructuración de un dominio de la

membrana plasmática de S. cerevisiae. Usted ha descubierto una nueva proteína, que decidió
llamar Lsp1. Esta nueva proteína es estructuralmente muy similar a Pil1, por lo que usted cree
que podría localizarse en este dominio. Para comprobar su hipótesis, decidió estudiar co-
localización entre estas proteínas. Cuenta con dos cepas modificadas de forma que el gen PIL1
se encuentra fusionado a una proteína de fluorescencia roja (mCherry) y una cepa con el gen
PIL1 fusionado a GFP, además un plásmido que contiene el gen GFP junto con un marcador de
selección.
W303 MAT PIL1-mCherry-LEU2.

W303 MAT PIL1-GFP-LEU2.

Describa en orden los pasos que realizaría para obtener la construcción en la que realice
una fusión en el c-terminal de Lsp1 con GFP. Determine que cepa utilizaría e incluya la
secuencia de los primers que utilice. Describa la secuencia del locus de interés de dicha cepa.

3- Usted está estudiando fusión en células de S. cerevisiae de tipo sexual alfa. Para eso,
utilizando la cepa W303 MAT genera mutantes en diferentes genes y analiza su capacidad de
crecer de forma polarizada hacia la feromona a. Desafortunadamente, se dio cuenta que se
quedó sin feromona para continuar con sus experimentos y, por motivo de la pandemia, no
realizarán entregas de la misma. Sabe entonces que debe modificar a las levaduras de manera
que produzcan la feromona marcada y de este modo pueda ser purificada. Cuenta con la
colección de plásmidos publicada en Janke y col. (Yeast 2004; 21: 947–962).

Describa los pasos que realizaría para obtener una cepa a partir de la cual pueda sobre-
expresar y purificar la feromona a. Describa la secuencia del locus de interés de dicha cepa.
4- Ud quiere saber si las proteínas Ire1 y Lam4 colocalizan en S. cerevisiae. Para ello Ud cuenta
con las cepas BY4741, BY4742 y la colección de plásmidos descriptos en el trabajo de Lee y
col. (PLoS ONE 8(7): e67902; doi:10.1371/journal.pone.0067902, 2013). Y además una colega
le mandó las siguientes cepas:

BY4741 IRE1-yomCherry-kanR

BY4741 LAM4-yoEGFP-CaURA3

Describa el procedimiento para obtener una cepa donde pueda observar si Ire1 y Lam4
colocalizan. Ud sabe que las fusiones al extremo c-terminal de ambas proteínas son funcionales.
Describa las secuencias de los locus de interés de dicha cepa.

5- Ud desea expresar en grandes cantidades la proteína Pkh2 con el fin de purificarla y realizar
ensayos de fosforilación in vitro. Ud. sabe que medianas o grandes cantidades de Pkh2 resultan
tóxicas para S. cerevisiae y detienen el crecimiento de su cultivo. Cuenta con la colección de
plásmidos publicada en Janke y col. (Yeast 2004; 21: 947–962). Describa que plásmido elegiría
para lograr su objetivo, los primers y las secuencias de los locus de interés de la cepa resultante.

6- Ud estudia la respuesta de las levaduras a la feromona sexual y quiere desarrollar una cepa
que se torne fluorescente solamente en presencia de la feromona alfa. Para ello cuenta con los
plásmidos pKT90 y pKT209 publicados en Sheff & Thorn (Yeast 2004; 21: 661–670). Ud sabe
tambien que la transcripción de genes como FUS1, PRM1 y FIG1 es fuertemente inducida en
presencia de feromona. Describa el procedimiento y los primers que utilizaría y las secuencias
de los locus de interés de la cepa. a construir.

7- Se sabe que Fig1 es una proteína integral de membrana requerida para el apareamiento. En
células mutantes de este gen, fig1Δ, se observó un defecto de fusión celular, el cual se revirtió
por altas concentraciones de Ca2+, lo que indicaría que regula el sistema de entrada de Ca2+
que afecta la fusión celular. Usted sospecha que un gen con el que está trabajando, MID1,
denominado de esta manera por muerte inducida por el apareamiento, también está involucrado
en la entrada de Ca2+ a la célula. Es por este motivo que decide estudiar las variaciones que se
dan en presencia y ausencia de Ca2+ en células mutantes de MID1. En el laboratorio usted
cuenta con el conjunto de plásmidos descriptos en el trabajo de Longtine y col ( Yeast 14, 953–
961, 1998). Describa qué plásmido elegiría para realizar la deleción del gen, los primers y la
secuencia del locus de interés de la cepa resultante.

8- Ud quiere saber si las proteínas Gal80 y Sur7 colocalizan en S. cerevisiae. Para ello Ud
cuenta con las cepas BY4741, BY4742 y la colección de plásmidos descriptos en el trabajo de
Lee y col. (PLoS ONE 8(7): e67902; doi:10.1371/journal.pone.0067902, 2013). Y además una
colega le mandó las siguientes cepas:

BY4741 GAL80-yomRuby-KanR

BY4741 LAM4-yomWasabi-SpHis5

Describa el procedimiento para obtener una cepa donde pueda observar si Ire1 y Lam4
colocalizan. Ud sabe que las fusiones al extremo c-terminal de ambas proteínas son funcionales.
Describa las secuencias de los locus de interés de dicha cepa.
9- Ud estudia la respuesta de las levaduras a la feromona sexual y quiere modificar la siguiente
cepa:

BY4741 natN2-pADH1-3HA-PIL1 (construida utilizando el plásmido pYM-N8 de Janke y col.,

Yeast 2004; 21: 947–962) de modo tal que se su citosol se torne fluorescente solamente en
presencia de la feromona alfa. Para ello cuenta con los plásmidos pKT90 y pKT209 publicados
en Sheff & Thorn (Yeast 2004; 21: 661–670). Ud sabe tambien que la transcripción de genes
como FUS1, PRM1 y FIG1 es fuertemente inducida en presencia de feromona. Describa el
procedimiento y los primers que utilizaría y las secuencias de los locus de interés de la cepa a
construir.

10- Se sabe que Mid1 es una proteína que está involucrada en la entrada de Ca2+ a la célula.
Una cepa mutante BY4741 mid1:: natN2 incorpora Ca2+ a una tasa 30% menor que la cepa
silvestre. Ud sospecha que el gen FIG1 es responsable de la incorporación de Ca2+ y por lo
tanto decide generar una doble mutante y al mismo tiempo probar los reactivos de
CRISPR/Cas9 que le envió su colega Juan Marcos Daran, autor correspondiente del trabajo doi:
doi: 10.1093/femsyr/fov004. Utilizando entonces esta técnica describa que secuencia blanco y
que primers va a encargar para eliminar por completo el ORF FIG1.