Diagramas de energía de una molécula fluorescente

Fluorescencia de resonancia  radiación emitida es de igual  que la radiación

empleada para la excitación
Fluorescencia  excepto la de resonancia, las ´s son mayores 2
(desplazamiento Stokes)
 Espectros de emisión

Los espectros de fluorescencia tienden a ser imágenes especulares de los espectros de

absorción. La energía emitida es menor debido a las perdidas por las transiciones
vibracionales.
VARIABLES QUE AFECTAN LA FLUORESCENCIA
Regidez estructural
Temperatura del disolvente
El efecto de un aumento en la temperatura incrementa el número de choques
moleculares, por lo que la desactivación tiende a efectuarse a través de procesos
no radiativos y por lo tanto se inhibe la fluorescencia.
La viscosidad del solvente tiene efectos similares, a mayor viscosidad menor
número de choques moleculares y mayor intensidad de fluorescencia.
La polaridad del solvente también tiene influencia en la fluorescencia, debido al
efecto hipsocrómico y batocrómico que el solvente ejerce sobre el compuesto.

Efecto del pH
Debido a las diferentes formas químicas que son posibles de existir a diferentes
condiciones de pH, la intensidad de fluorescencia también es afectado por este
factor. Ejemplo: el fenol y el ión fenolato tienen diferentes propiedades
fluorescentes, por lo que si las condiciones son de pH básico la especie estará en el
equilibrio químico en la forma del fenol y/o ion fenolato, afectando así la
intensidad de fluorescencia.

Efecto del Oxigeno disuelto

Debido al paramagnetismo de la molécula de oxígeno, esta tiende a desactivar
cualesquier estado activado por oxidación fotoquímica de la especie
fotoluminiscente, provoca cruzamiento intersistemas y conversiones de las
moléculas excitadas al estado triplete .por lo que es deseable que el oxígeno no se
encuentra presente en solución o su concentración sea mínima
Efecto de la concentración
La potencia de la radiación fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de
excitación que es absorbido por el sistema.

Con objeto de relacionar F con a concentración c escribimos la ley de Beer

así:

sustituyendo nos queda:

Si desarrollamos el término exponencial como una serie de Maclaurin será;

Siempre que 2,303ebc < 0,05 podemos escribir que,

y si P0 se mantiene constante,
 Moleculas fluorescentes:

Compuestos Orgánicos y Bioquímicos:

Adenina, ácido antranílico, cisteína, hidrocarburos aromáticos policíclicos, indol, naftol,

proteínas, ácido salicílico, escatol, triptófano, ácido úrico, adrenalina, alquilmorfina, LSD,
penicilina, fenobarbital, procaína, reserpina, clorofila, alcaloides, flavonoides, esteroides,
ácido ascórbico, ácido fólico, nicotinamida, piridoxal, corticoesteroides, estrógenos,
progesterona, andrógenos, ácidos biliares, colesterol, triglicéridos, creatinina,
deshidrogenasas, transaminasas, fosfatasas, perioxidasas, ATP, luciferina, luciferasa,
vitaminas: A, B1, B2, B6, C y la E, etc.

Compuestos Inorgánicos:

Cianuro, fluoruro, sulfatos, fosfatos, aluminio, arsénico, berilio, boro, calcio, magnesio,
tierras raras, selenio, uranio, etc.

Aplicaciones:

Las aplicaciones más importantes en la fluorométria son en análisis de alimentos, de

productos farmacéuticos, de productos naturales y en análisis clínicos.
Estructuras moleculares de compuestos orgánicos fluorescentes

fluoresceína

Derivados de pirazina
Fluorescencia: moléculas utilizadas por sus propiedades fluorescentes.
DAPI ALEXA 555 GFP

Proteínas fluorescentes (GFP,

ALEXA 488 CFP, YFP, Alexa 488. FITC, Cy3,
Texas red DAPI, etc).

Una núcleo de un linfocito marcado con

diversos fluorocromos: DAPI (azul, tiñe el ADN;
y secuencias específicas de dos pares de
cromosomas, en verde y rojo (FISH).
Imágenes fluorescentes:
 Tinción de ADN
• Generalmente se utilizan agentes intercalantes: DAPI, ioduro de propidio, etc.
• Permiten ubicar células por sus núcleos, estudiar mitosis, ciclo celular, cariogramas,
apoptosis.
• También se pueden ubicar genes o secuencias particulares utilizando sondas fluorescentes
específicas.
Tinción de componentes celulares y organelas • Núcleo
• Citoesqueleto: utilizando anticuerpos • Organelas: colorantes específicos que se
específicos o empleando falloidina para unen a algunas organelas. También utilizando
identificar microfilamentos de actina. anticuerpos dirigidos contra proteínas que se
encuentran en determinados compartimentos
celulares
 COMPONENTES PARA INSTRUMENTOS EN
ESPECTROSCOPÍA OPTICA

EMISIÓN

ABSORCIÓN
UV/VISIBLE

ABSORCIÓN
INFRARROJA

FLUORESCENCIA

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Fluorometría:
La intensidad de la radiación emitida es
proporcional a la concentración del analito.

I=K[X]

Limitaciones:
• A altas concentraciones se incrementa la probabilidad
de que un fotón emitido sea absorbido por otra
molécula en la muestra (self-quenching).

• Otros componentes en la muestra y el solvente

pueden absorber la radiación emitida.

• El aumento de temperatura reduce la florescencia

(mayor numero de colisiones)