GÉNETICA MOLECULAR Y REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

I. REPLICACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

TEMA 1. REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS

I.1 Características generales de la replicación

Los mecanismos de replicación tienen técnicas de laboratorio como por ejemplo la PCR y la
secuenciación. La replicación se bloquea con agentes terapéuticos para células tumorales. Hay
otras drogas como los antivirales que tienen su acción sobre proteínas de replicación.

- La replicación está sujeta a un control preciso, es decir, se encuentra acoplada con la

división celular para que haya una cantidad de DNA viable. Esto es diferente entre
procariotas y eucariotas (en estos últimos la replicación ocurre solo en la fase S).
- La replicación es semiconservativa, es decir, el DNA de nueva síntesis tiene una hebra
procedente de la molde y otra de nueva síntesis. Watson y Crick ya intuyeron que su
modelo de doble hélice sugería un mecanismo semiconservativo de duplicación. Los
que lo probaron fueron Meselson y Stahl en 1958, que se propusieron distinguir de
manera experimental entre las siguientes posibilidades de replicación: conservativa,
dispersiva y semiconservativa.
A) Modelo semiconservativo: Cada molécula hija de DNA está
formada por una cadena parental y una cadena de nueva
síntesis.
B) Modelo conservativo: Una de las moléculas de DNA hijas
estaría formada por dos cadenas de DNA parental, y otra
estaría formada por dos cadenas de nueva síntesis.
C) Modelo dispersivo: Ambas moléculas hijas de DNA,
estarían formadas por mezclas de fragmentos nuevos y
parentales.
El experimento de Meselson-Stahl se basa en el uso de
nitrógeno marcado y en la centrifugación en gradiente de
densidad.
Si tienes a E. Coli en un medio con isótopo N 15, esos nucleótidos se van a marcar con él y todo
el DNA va a estar marcado con N 15. Si a esas bacterias (que ya están marcadas) las cambias a
un medio con N14, los nucleótidos que se originen de la división van a estar marcados con N 14.
De esta manera, se va a distinguir el DNA que estaba marcado con N 15 y con N14 porque
centrifugan de forma diferente.

Con el cloruro de cesio se va a formar un gradiente de densidad de sal hasta que el DNA se
encuentra con una densidad similar (el N14 se queda más arriba que el marcado con N 15). De
esta forma se diferencian las cadenas que estén marcadas de una forma o de la otra (DNA
parental y de nueva síntesis).

a) Por un lado, si coges el DNA parental y lo centrifugas, obtienes una banda en N15.
b) Por otro lado, si las pones después de la primera replicación en medio con N 14, se van a
situar en una banda entre N14 y N15 (de esta forma se descarta el conservativo porque
 aparecerían 2 bandas, una arriba y otra abajo). En la primera replicación también se
podría descartar la dispersiva si se desnaturaliza el DNA.
c) Asimismo, si se dejan que se repliquen una vez más (generación 2), van a haber nuevas
cadenas con N14 y otras con N15 y de esta forma aparece una banda entre medias y otra
en cada N (de esta forma se descarta la dispersiva porque si no, solo se obtendría la
banda del medio más gruesa). En las generaciones siguientes hay una disminución
progresiva de la cantidad de DNA con marcado con N15, apareciendo
mayoritariamente DNA con N14.

De esta forma descubrieron que la replicación era semiconservativa.

Además, tenían la ventaja de que las bacterias crecían despacio y no se solapaban

etapas de replicación. En bacterias se pueden solapar las rondas de replicación  la
bacteria nueva hereda DNA que ya está empezando a replicarse. Esto sucede cuando
las bacterias se ponen a crecer con medios de cultivo y oxigenación. Sin embargo, en
aquel momento las condiciones que tenían daban lugar a replicaciones sin
solapamiento. Además se les rompía el DNA y obtenían fragmentos que les facilitaba el
estudio (la mayoría del DNA estaba replicado o sin replicar, sin presencia de moléculas
parcialmente replicadas de densidad intermedia).

- La replicación es semidiscontinua. Tenemos la

síntesis de la hebra continua (leading strand) y la
discontinua (lagging strand) porque la doble hélice
tiene una polaridad en el que las hebras son
complementarias y se disponen de forma
antiparalela. El DNA se abre en la horquilla de
replicación (replication fork) en la leading strand y la
polimerasa sintetiza en forma 5´-3´. En la otra
cadena la polimerasa no puede llevar a cabo la
síntesis debido a la polaridad. Es por ello por lo que
Okazaki demostró que hay una síntesis de la lagging
strand en la que unos fragmentos se van uniendo
por una serie de proteínas (síntesis discontinua).

Experimento de Okazaki:

Okazaki marcó el DNA que se iba sintetizando con tritio ([H 3]timidina). Este lo corría en un
gradiente de sacarosa alcalino en el que el DNA se desnaturalizaba obteniendo así hebras
sencillas. El eje de abajo es el tubo por lo que el DNA más grande da picos al fondo del tubo.
Después se recogen alícuotas para mirar la cantidad de radioactividad que hay en todos
(donde haya pico de radiactividad es donde hay DNA).

A él le sale que cuando hace el ensayo a 2 segundos, no hay ningún tamaño grande, pero, a
medida que se avanza el tiempo, aumenta el pico de tamaño pequeño y un poco el tamaño
grande. A 120 segundos el pico grande ha aumentado
mucho. Por tanto, al principio se obtienen los
fragmentos de Okazaki y después estos se van uniendo
y así se obtienen los trozos grandes.

Para demostrarlo, utilizó un mutante de ligasa de E.

coli ya que esta es la encargada de unir los fragmentos.
Cuando utilizó el mutante, los fragmentos grandes no seguían creciendo ya que, a diferencia
del wild type, los fragmentos pequeños no se unían y se acumulaban.

La leading strand no está en una sola pieza porque se originan constantemente mutaciones y
por tanto aparecen trozos grandes. Por eso no aparece ninguna hebra entera desde el
principio.

I.2 DNA polimerasas: química de la síntesis, estructura

En la replicación, la enzima que sintetiza el DNA es la DNA polimerasa. Tenemos un primer (5´-
3´) que se hibrida a la hebra molde. La polimerasa siempre añade nucleótidos a un extremo 3
´OH de RNA o DNA. Si tenemos un DNA de cadena sencilla (ssDNA) no puede añadir nada
porque no hay molde.

Gracias al primer y al molde, la DNA polimerasa

puede reaccionar utilizando nucleótidos trifosfato
como sustrato (α,  y ). El fosfato en α se queda
unido y los fosfatos  y  salen en forma de
pirofosfato que se degrada para dar lugar a dos
fosfatos independientes liberando así energía (esta
reacción es irreversible).

Esto lo va a hacer continuadamente cada vez que añade un

nucleótido nuevo a la cadena de nueva síntesis. Además para
polimerizar necesita iones divalentes  Mg2+ o Mn2+ (diferente
fidelidad).

La polimerasa hace muchas reacciones diferentes a la vez ya que

mete diferentes nucleótidos de forma complementaria. Sin
embargo, esta enzima tiene solo un centro activo por lo que
detecta que el nucleótido que meta forme una hélice regular (los
nucleótidos son del mismo tamaño). Por tanto, controla que se
mantenga la regularidad de la estructura. A la DNA polimerasa no
le importa tanto el dNTP que está añadiendo como si mantener la
regularidad en la estructura del DNA. Hay diferencias, pero en
general es regular porque los cuatro apareamientos de bases
tienen la misma distancia (AT, TA, CG, GC).
Para sintetizar el DNA, por el centro activo (donde se encuentra el extremo del primer) están
pasando constantemente nucleótidos y cuando este es el correcto, se forman los puentes de
hidrógeno y por tanto se coloca el fosfato en α muy cerca del extremo 3´OH y dándose así la
reacción. El dNTP correcto se une con más afinidad al centro activo de la polimerasa y la
reacción se realiza más rápidamente. Sin embargo, algunas veces se originan reacciones
incorrectas.

La polimerasa se parece a una mano derecha. Donde se produce

la síntesis de nucleótidos es palm (donde se encuentra el sitio
catalítico). El template gira ya que solamente entra en el centro
activo el nucleótido que va a unirse al nuevo nucleótido de
síntesis. En ese centro catalítico, hay dos aspárticos que son
importantes porque coordinan unos iones magnesio que
coordinan a su vez los nucleótidos y los fosfato. El dNTP aparea
por puentes de hidrógeno con el NTP correspondiente en el
molde e interacciona con dos metales divalentes que le colocan
en la posición correcta para que se produzca la catálisis. Es por
ello por lo que hay que añadir iones magnesio para que funcione
la reacción siempre que se hayan formado bien los puentes de H.

Si en vez de meter un nucleótido trifosfato, se mete un

dideoxinucleotidotrifosfato, no tiene el OH del 3´, por lo que se
mete igual pero se para la reacción (se utiliza en secuenciación
para que se pare donde se introduce).

En los fingers, cuando entra el nucleótido, hay una alfa hélice que baja  una tirosina actúa y
hacen que no entre agua y no haya hidrólisis (es como una grapadora que va fijando la
reacción).
 Actividades de las DNA polimerasas

Los errores que se cometen cuando se duplica el DNA es

con una tasa de 1010 (muy bajo). Es por ello, por lo que
gracias
a las

variaciones, hay evolución. La polimerasa por sí misma tiene una tasa de error de 10 -5 (es
demasiado alta). Por tanto, esta enzima tiene una actividad exonucleasa 3´- 5´que le ayuda a
corregir los errores que va cometiendo (normalmente son errores tautoméricos). La
polimerasa detecta la distorsión de la doble hélice y el DNA medio suelto  tiene afinidad por
el centro de la actividad exonucleasa que se encarga de eliminar el nucleótido y vuelve al sitio
de polimerización. Esa actividad es muy variable pero hace que la tasa varie de una tasa de
error de 10-5 a la 10-7. Sin embargo, este pasa a 1010 gracias a los mecanismos de reparación
que repasan los fallos. También se llama actividad de corrección de copia o proofreading (esta
no la tiene la Taq polimerasa por lo que comete muchos más errores).
Por lo tanto, las actividades de las DNA polimerasas son:

- Polimerasa 5’-3’, actividad de síntesis de DNA

- Exonucleasa 3’-5’, actividad de degradación de DNA o proofreading.

Los extremos desapareados tienen baja afinidad por el sitio activo de polimerización, y el
extremo ssDNA del primer tiene alta afinidad por el sitio activo de exonucleasa.

La primera DNA polimerasa se encontró en E. coli y fue la I. Esta sirve para eliminar el primer
de RNA y lo rellena por DNA. Esta tiene por tanto, actividad polimerasa, exonucleasa 3´- 5´ y
también la exonucleasa 5´- 3´.

La DNA polimerasa repara el DNA al final de la

replicación porque los primers en eucariotas son de
RNA (porque las RNA polimerasas pueden sintetizar
de novo). Entre el fragmento de Okazaki y el primer
hay un Nick (un espacio) ya que falta un enlace
fosfodiéster (se encarga de unirlo la ligasa). La
polimerasa puede entrar en ese Nick y, por su última
actividad, se come el RNA y, con la 1º actividad
extiende el DNA hasta el DNA. Por tanto el Nick se
transloca al hueco entre los dos DNA. A la vez que
extiende el DNA, utiliza la 2º actividad para que no
haya errores. Ese Nick es unido por la ligasa.

Las dos actividades primeras están en el mismo polipéptido mientras que la 3º está en otra
parte y puede ser eliminada por una proteasa. De esta manera se creó el fragmento Klenow
que se trataba de una polimerasa I con actividad exonucleasa 5´- 3´ (esta era la que se utilizaba
al principio para hacer las PCR).

E. coli tiene tres polimerasas diferentes por lo que se preguntaron cuál de ellas estaba
involucrada directamente en la replicación.

o DNA polimerasa I: Los mutantes de la DNA polimerasa I (polA-) replican el DNA → la

DNA polimerasa I no está implicada en replicación. Además, dichos mutantes polA- son
más sensibles a la luz ultravioleta → la DNA polimerasa I está implicada en reparación
de DNA.
o DNA polimerasa II: Los mutantes de la DNA polimerasa II (polB-) replican el DNA → la
DNA polimerasa II no está implicada en replicación. La DNA polimerasa II está
implicada en reparación de DNA.
o DNA polimerasa III: implicada en la replicación
Se encontró antes la polimerasa I porque había muchas copias por célula, mientras que de la III
había muy pocas. Son necesarias 2 polimerasas III por horquilla y con 4 ya se puede hacer la
replicación; sin embargo, hay 400 copias de la DNA polimerasa I. La procesividad se puede
utilizar para cualquier proteína y mide cuántos nucleótidos puede meter hasta que se caiga. La
más procesiva es la III y por ello es la replicativa ya que no se cae hasta que no se acabe de
replicar todo el DNA. La DNA polimerasa I es poco procesiva debido a que tiene que sustituir el
primer (si fuera muy procesiva sustituiría cosas que no son necesarias sustituir).

La replicación es rápida (alrededor de 100-1000 pb/segundo) y completa ya que no se queda

ningún pb del genoma sin replicar. Las polimerasas tienen ayuda de la pinza deslizante que se
une alrededor del DNA y de la polimerasa y la sujeta al DNA cuando se quiere caer (aumenta
su procesividad). La polimerasa 29 tiene un loop y puede sintetizar DNA muy grandes sin
caerse. La pol29 no necesita pinza deslizante.

1.3 Replicación del DNA procariota: iniciación

Teoría del replicón (Jacob, Brenner)

Replicón: unidad de replicación de DNA, con origen, terminación y cualquier otro elemento
necesario para la replicación.

Según este modelo, en la iniciación de la replicación se requieren

dos componentes:

- Un replicador (origen de la replicación).

- Una proteína iniciadora reconocer el origen de replicación,
abre las dos cadenas de DNA en el origen y recluta la
maquinaria de replicación.

Ellos lo propusieron pero no lo probaron, solo establecieron este modelo.

Posteriormente, se intentó buscar ese origen de replicación y se pensó que debía ser un
fragmento de DNA. Para ello, cogieron todo el DNA de E. coli y cuando lo estudiaron no sabían
en qué parte estaba, pero, dijeron que si estaba ahí y
lo fragmentaban, solo aquellos fragmentos que lo
tuviesen y se uniesen a plásmidos que no se
replicasen, iban a poder replicar. De esta manera
podían ver en qué fragmento inicial se encontraba el
origen de replicación. Es por ello por lo que si al cortar
el fragmento, perdía capacidad de replicación, sería
porque habrían cortado bases del propio origen.

Sólo las células que portan el plásmido recombinante

con resistencia a antibiótico y el oriC forman colonias
presencia de antibiótico. De esta manera obtuvieron
el fragmento de DNA que era el mínimo necesraio
para que el plásmido se replicase. Esre es el oriC que
tiene una longitud de 245pb.

Con esas bases, las compararon con orígenes de replicación de otros organismos procariotas y
se dieron cuenta de que tenían estructuras similares y modulares.

Estructura modular de oriC de E.coli

Tenían unas secuencias con 13bp que se repetían 3 veces con secuencias consenso 1:
GAATCTNTTNTTTT. Se ve una gran cantidad de timinas. La secuencia se llama DUE (DNA
unwinding element). Unwinding significa desenrollamiento.

Como los pares de bases A-T tienen menos puentes de H (2), es más fácil que se abra por ahí y
en esas secuencias hay muchas bases A-T por lo que puede desenrollarse con facilidad.

Ejemplo de secuencia consenso:

1
Secuencia consenso: secuencia que más se mantiene en una misma posición, es decir, la
secuencia que es más probable que ocurra en cada una de las posiciones. La secuencia
consenso no tiene porqué ser la que está siempre, puede estar o no, porque sólo indica qué
base es más probable, pero puede diferir en determinadas posiciones.
También en el oriC tenemos las cajas DnaA donde se unen las proteínas iniciadoras. Tiene una
secuencia consenso de 9pb que es TTATCCACA.

En el oriC también hay secuencias GATC que son reconocidas por Dam metilasa (esto lo
veremos más adelante).

También hay sitios de unión para otras proteínas (FIS, IHF).

En procariotas sólo hay 1 origen de replicación y esta es bidireccional (replicación hacia

derecha e izquierda). Esto lo hicieron marcando con radioactividad y se dieron cuenta que la
parte de nueva síntesis (la más gorda) era la más radioactiva y que esta se encontraba a ambos
lados.

1. Iniciación

DnaA (proteína iniciadora): Se combina con ATP y se

une al DNA. Al unirse al DNA provoca una torsión
helicoidal negativa y hace que, sumada a la interacción
más débil A-T, el DNA se abra dejando expuestas las
secuencias DUE.

Después se une la DnaB (helicasa) a ssDNA. En este

caso, se tiene que unir una helicasa en cada una de las
hebras. Esta se encarga de romper los puentes de H.
Esta helicasa se une en sentido 5´- 3´ y, sin ella, la
polimerasa no tiene fuerza para replicar.

La helicasa necesita un cargador de helicasa que es la

DnaC. La abre, la coloca en el DNA y la cierra. De esta
manera, la helicasa ya no se cae hasta que se acabe la
replicación.
Ahora es necesario sintetizar un primer. Esto lo hace la DnaG o primasa que se une a la DnaB y
cataliza la síntesis del primer RNA. Se trata de una RNA polimerasa porque estas no necesitan
un extremo 3´OH.

Según se va separando el DNA, este queda suelto y, por tanto, se origina el problema de que
queda mucho ssDNA suelto (puede degradarse muy fácilmente o formar estructuras 2ª). Es por
ello por lo que las proteínas SSB se unen al ssDNA, lo cubren y lo protegen.

Ahora bien, para llevar a cabo la replicación, las DNA polimerasas necesitan un extremo 3´OH
que en la replicación procariota es proporcionado por un primer RNA sintetizado por la
primasa.

La capacidad de desplazamiento la pueden llevar a cabo algunas polimerasas y consiste en

romper los puentes de H e ir levantando las bandas de DNA que tengan delante.

Proteína iniciadora DnaA

La proteína iniciadora tiene actividad ATPasa por lo que

solo está activa en presencia de ATP. Posteriormente,
este se hidroliza a ADP inactivando la proteína
iniciadora. Es por ello, por lo que al empezar la
síntesis, se hidroliza el ATP y no puede volver a iniciar
la replicación en el origen. Esto es importante, porque
ayuda a controlar que no haya más de un origen.

La iniciación comienza con el DNA completamente

metilado en la secuencia del oriC y en asociación con la
membrana interna.

Helicasa DnaB

La helicasa también tiene actividad ATPasa, polaridad 5´-3´ y es procesiva. DnaB no puede
abrir un dsDNA, solo puede unirse y desenrollar un dsDNA cuando esté ya abierto (por la
DnaA).
 Cuando la helicasa se va moviendo, aparece el ssb
cooperativamente (cada vez que se une una, se van uniendo
con más afinidad). Sin embargo, la polimerasa tiene más
afinidad y es por ello, por lo que se van cayendo.

Al actuar la helicasa aparece ssDNA.

SSB (Single Strand DNA Binding Protein)

Impiden la formación de estructuras secundarias, protegen al DNA, y se unen de forma

inespecífica y cooperativa.

1.4 Replicación del DNA en procariotas: Elongación

La DNA polimerasa III holoenzima está compuesta por:

- Polimerasa III core (enzima mínimo) 

es el núcleo de la polimerasa con las
actividades vistas antes.
 o Polimerasa 5´-3´ subunidad α
o Exonucleasa 3´-5´  subunidad 
- Sliding clamp o pinza deslizante  subunidad 
- Cargador de pinza  complejo 
- Dimerización  subunidad  (regula la polimerasa de la lagging y de la leading)

La pinza deslizante la hay en procariotas y eucariotas y están muy conservadas aunque tienen
una secuencia y origen muy diferentes. Son aros proteicos con alfa hélices orientadas hacia
dentro pero al haber evolucionado de forma diferente, las secuencias son distintas.

El cargador abre la pinza deslizante, la coloca en el dsDNA y la cierra.

La polimerasa de la lagging strand, cuando llegue al primer, se va a caer y otra primasa va a

sintetizar otro primer, por lo que tendrá que colocarse la pinza deslizante para que se vuelva a
unir al extremo 3´OH en aquellos trozos donde no haya sintetizado DNA; y, así continuamente
dando lugar a los fragmentos de Okazaki. Es por ello, por lo que en esta cadena, la polimerasa
se va soltando y uniendo para sintetizar la hebra discontinua.
1.5 Replicación del DNA en procariotas: Terminación

Como la replicación comienza en el origen, y el DNA de las bacterias es de doble cadena y

circular, en un primer momento las paraban de forma artificial. Sin embargo, buscaban unos
sitios donde se paraban con unas secuencias determinadas que son los sitios Ter. Ahí se une la
proteína Tus (contrahelicasa) que tiene que estar orientada de una determinada manera para
parar a las helicasas. De esta manera se acaba la replicación en procariotas.

Hay varias paradas para que en caso de mutación, en uno de los sitios se logre al menos la
parada en otro punto. Realmente es el primero el que para, que son TerA para la que viene por
la izquierda, y TerC para la de la derecha.

Sólo con la orientación adecuada puede parar Tus a la helicasa.

2. Unión de los fragmentos de Okazaki

Ahora tenemos un DNA con fragmentos de RNA de los primers. Aquí actúa la RNA polimerasa I
con su actividad exonucleasa 5´-3´. De esta manera, luego la ligasa forma el enlace fosfodiéster
en los Nicks.

Experimento: La DNA polimerasa I, se utilizaba antes para marcar el DNA por Nick translation
que funcionaba así: si quieres marcar el DNA con radioactividad, primero utilizabas una
DNAasa que degrada el DNA de una forma controlada, formando de esta manera Nicks en el
DNA (no altera el DNA de doble cadena). Si después le pones la DNA polimerasa I y un
nucleótido marcado radioactivamente en el fosfato-α, dATP, dCTP, dGTP, dTTP  La
polimerasa va a degradar lo de delante y extender el DNA añadiento dntps, y lo puede hacer
con cualquiera, pero con el dATP lo puede sustituir el radioactivo o no. De esta manera se
trasladaba el Nick.
1.6 Problemas topológicos de la replicación

Si vamos abriendo la doble hélice de DNA al replicarlo, como el extremo del otro lado no gira,
se van a crear tensiones (se producen supervueltas positivas delante de la horquilla de
replicación). Es por ello, por lo que existe la topoisomerasa (girasa) que impide el
superenrollamiento. El superenrollamiento de DNA tiene unos parámetros por lo que se puede
medir.

La

topoisomerasa corta el DNA,

lo deshace y desenrolla y lo vuelve a unir de forma que solo haya
superenrollamientos negativos.

La girasa (topoisomerasa II) elimina las supervueltas positivas que

se forman delante de la horquilla de replicación.

En el caso de bacterias, cuando acaba la replicación, las dos

moléculas hijas desencadenantes se encuentran catenadas, es
decir, los dos genomas se encuentran unidos  la
topoisomerasas IV las abre y las separa.

1.7 Control de la replicación en procariotas

 Inhibición de las reiniciaciones

El control de la replicación se efectúa a nivel de iniciación.

Esto se hace mediante las secuencias GATC que reconoce la DAM metilasa, una enzima que
mete metilos cuando lo reconoce.

Para que se inicie la replicación, debemos tener

las dos cadenas metiladas. Después de la
replicación semiconservativa, el oriC está
hemimetilado* y se mantiene en este estado
durante 13 minutos aproximadamente. La
proteína SeqA se une al DNA hemimetilado e
impide que se una la Dam metilasa.
Mutaciones que inactivan la proteína SeqA,
reduce el tiempo que tarda el origen en
metilarse.

Si hubiese una mutación, para que los sistemas

sepan cual de las dos cadenas está mal (la
nueva o la parental), como la que hay que
cambiar es la nueva, la metilación indica sobre
cuál actuar (la nueva es la no metilada).

 Hemimetilado = parentales metiladas y

nuevas no

El mecanismo de control de la replicación implica:

- Secuestro del origen

- Retraso en la metilación
- Hidrólisis de ATP unido a DnaA
- Represión de la transcripción de DnaA
- Secuestro de DnaA

La DnaA está unida a ATP por lo que tiene que recuperarse una vez
se ha hidrolizado porque si no se encontraría de forma inactiva. Por
otra parte, también DnaA también es capaz de bloquear su propia
transcripción uniéndose a su propio promotor (evita su síntesis).

La DNA pol puede meter errores por lo que habrá una zona de la hélice que esté desapareada,
si no lo corrige la actividad exonucleasa, aparecen los sistemas postreplicatorios de reparación.
Sin embargo, estos saben que el error está mal porque la nueva cadena no está metilada. Ese
rato que tardan en metilarse, es el que utilizan para reparar aquellas bases que no estaba
metilada.

Implicaciones  ayuda a controlar inicio de replicación una vez secuestrado y ayuda a la

reparación postreplicativa porque discrimina la hebra de nueva síntesis de la parental.

¿Cuánto tarda E. coli en replicar su genoma?

El DNA de E.coli tiene un tamaño de 4,2 x 10 a la 6 pb y la velocidad de replicación es de 1000

pb/sg. Como la replicación es bidireccional tarda la mitad de ese tiempo, aproximadamente 40
mins.

Tiempo C = tiempo de replicación = 40 min

Tiempo C  tiempo de replicación, es

constante

Tiempo D  tiempo que tarda desde

que se replica el DNA hasta que la
célula se divide. Es constante. Son 20
mins en E.coli

Tiempo T  tiempo de generación es

variable entre 20´- 60´.

Si hay tiempos de generación menores al tiempo C + tiempo D, significa que hay rondas de
replicación solapadas. A la vez que se está acabando la replicación, se inicia otra nueva. De
esta manera el tiempo de generación disminuye.

Menselson y Stalh lo estudiaron con el modelo de 60´en el que no se solapaban las

replicaciones.

Cuestiones replicación

1. Predecir la localización de las mutaciones con los siguientes fenotipos:

a) el DNA recién sintetizado presenta muchos desapareamientos  exonucleasa 3´- 5´.
Si tiene muchos desapareamientos es que ha metido muchos nucleótidos
incorrectamente.
b) acumulación de fragmentos de Okazaki  ligasa
c) no hay iniciación de replicación  primasa, proteína iniciadora o cualquiera de las
proteínas implicadas en la iniciación
d) la síntesis de DNA es muy lenta  pinza deslizante de la polimerasa, helicasa, etc.
e) no se termina la replicación y se acumula DNA superenrollado  topoisomerasa II
(girasa)
2. ¿Qué proteína desenrolla el DNA en la horquilla de replicación? ¿qué ocurre delante
de la horquilla de replicación al desenrollarse el DNA y cómo lo soluciona la célula?
¿qué le ocurre a la replicación si no se soluciona?
La proteína que desenrolla el DNA en la horquilla de replicación es la topoisomerasa II
(girasa). TODO EXPLICADO EN LOS APUNTES

3. ¿Cuál es la función de la subunidad  de la DNA polimerasa III de E. coli?

¿necesitará una subunidad  la DNA polimerasa II? ¿por qué?
La función de la subunidad  es aumentar la procesividad y la II no la necesita porque
su función es reparativa y, por lo tanto, no tiene que quedarse unida al DNA.

4. La DNA polimerasa I de E. coli no está implicada en el proceso de replicación, en la

síntesis de DNA, aunque sí en su reparación. Describe dos evidencias experimentales
que apoyen estos hechos.
La primera es que cuando el gen de la DNA pol I estaba mutado, se seguía produciendo
replicación y cuando se exponía a las bacterias a ultravioleta, eran más sensibles
porque esta polimerasa está dedicada la replicación.

5. En E. coli la metilasa dam metila adeninas en la secuencia GATC. ¿Qué consecuencias

biológicas tiene la metilación de estas secuencias en:
a) Replicación de DNA  forman parte del control del inicio de la replicación
b) Reparación  indica a los sistemas de replicación postreplicativos cuál es la cadena
que tienen que reparar (la que no está metilada)

6. Un grupo de científicos encontró una cepa bacteriana mutante que replicaba su DNA
con baja eficacia. Tras un extenso análisis genético y bioquímico descubrió una
actividad normal de las siguientes enzimas: DNA pol I y DNA pol III, DNA girasa y DNA
ligasa. Así mismo encontró niveles normales de las proteínas dnaA, dnaB, dnaC, SSB
y del factor s. Las regiones OriC y promotoras del cromosoma tampoco mostraron
ninguna mutación en la secuencia de nucleótidos. ¿Qué defecto podría explicar la
eficacia de replicación tan baja de este mutante? Explícalo brevemente.
Podría ser que un error/mutación en la primasa/ dnaG haga que la replicación sea tan
poco procesiva.

7. En un laboratorio alemán se han aislado cepas de la bacteria E. coli con mutaciones

sensibles a la temperatura. Por debajo de la temperatura restrictiva, los mutantes se
comportan como bacterias silvestres. En cambio, por encima de la temperatura
restrictiva aparece el fenotipo mutante. ¿Cuál será el fenotipo por encima de la
temperatura restrictiva de los siguientes mutantes? Explícalo brevemente
a) DnaB
b) DnaE
c) Ligasa
d) PolA I
e) Ssb
f) DnaG
g) recA
Mutantes condicionales: Si tenemos una bacteria mutante en la pol III, no podemos tener esa
bacteria en cultivo porque es una mutación letal. Las mutaciones condicionales pueden ser
sensibles a la Tª y que sí que se pueden usar para estudiar la replicación. Igual la bacteria tiene
una mutación y a 37ºC funciona bien (wt) pero a 40ºC es mutante. Podemos tenerla a baja Tª
creciendo y cuando subimos la Tª (Tª restrictiva), la mutación va a ser letal. Encontraron que
cuando pones a las bacterias a Tª permisiva (cuando puede crecer como wt).

Si hay buena Tª y oxigenación, la bacteria va incorporando radioactividad y esta va creciendo.

Si las bacterias son termosensibles y la pasamos de una Tª permisiva a restrictiva puede pasar
(dependiendo de las proteínas que estén implicadas):

- Que se pare de golpe la incorporación de radioactividad. Implicadas las de elongación

de la replicación.
- Que se pare lentamente hasta un punto en el que no incorpore
más. Implicadas las proteínas de iniciación. Las rondas de
replicación que ya estaban iniciadas se van a ir elongando
hasta que se paren pero las que no habían iniciado, no van a
empezar debido a la mutación.

Hay algunas proteínas que intervienen tanto en la iniciación como en la elongación, por lo que
se pararía siempre.

Proteínas con mutación termosensible:

- DNAG: mutación de parada en ambos procesos

- DNA A: iniciación
- Pinza deslizante: elongación

Si tenemos una bacteria nueva de la que quieres estudiar si las mutaciones están implicadas en
la iniciación o en la elongación  las pones a crecer y verías como es la parada de
radioactividad. Funcionan así porque estas mutaciones hacen las proteínas menos estables a
determinadas Tª.

8. Se ha realizado un ensayo de helicasa con los substratos indicados en las figuras, en

los que el fragmento corto de DNA está marcado con 32P. La figura de la derecha
muestra el mismo sustrato linearizado. Como control las muestras se hirvieron
(boiled). En las autoradiografías de los geles de agarosa se analizan los productos de
las reacciones indicadas. Interpreta los resultados. ¿Qué conclusiones se pueden
sacar?

Hay que fijarse en el sustrato que tenemos (un DNA de cadena sencilla de 5000 pb, hibridado a
uno de 200 pb que es radioactivo). Al final queda un DNA circular con una zona de cadena
doble y otra simple.

En gel de agarosa, se separan por tamaño. Si los dos son lineales, el más grande se queda
arriba. Si tienen el mismo tamaño, el circular va a correr de una forma diferente que el lineal
por lo que sólo se pueden comparar DNA lineales con los marcadores de peso molecular que
solemos usar. Si tenemos uno superenrollado, va a correr mucho más rápido que uno lineal.

Hay un gel de agarosa donde va a correr la muestra después de incubarla con los distintos
componentes que pone. Solo se ve la parte radiactiva tras poner el gel en una película.
 - Si se hierve la muestra, se separa el DNA grande del pequeño (desnaturalización), el
grande va a quedar arriba y no se va a ver porque el único marcado radiactivamente es
el pequeño. Eso es un control para saber el DNA que tenemos.
- Si se pone helicasa, la muestra sigue arriba (no funciona la helicasa para separar las
hebras).
- Cuando se pone ATP + helicasa, esta puede romper los puentes de H y así la muestra
se desplaza hacia abajo. Se separa la parte radiactiva de la que no.

Al lado derecho, la muestra ha sido linealizada con una enzima de restricción. Ha utilizado dos
tipos de helicasa, la muestra tal cual, hervida y con ATP.

En la muestra tal cual, sale la banda grande. Si se hierve, salen las dos separadas (125 pb y
75pb).

Las helicasas 5´-3´con ATP, se une a la cadena sencilla y se mueve hacia la derecha. Vemos la
banda de 75pb suelta y la otra marcada radioactivamente. Si utilizamos la otra, va a ir en
sentido contrario por lo que marca la de 125 pb.

Hay que explicar que pasa en cada uno de los carriles y lo que pasa en cada uno y porqué.

9. Interpreta la siguiente figura donde se muestra un experimento que mide la

actividad polimerasa y exonucleasa de una polimerasa:

Para ver la actividad exonucleasa y polimerasa de una polimerasa tenemos una polimerasa wt
y un mutante TPR2 (tiene una deleción). Miramos como es la actividad exonucleasa del
mutante respecto del wt.

Tenemos un sustrato que es un primer con 15pb marcado radioactivamente * y un template

con 21 mer (pb). Si le damos los nucleótidos necesarios, la polimerasa puede extenderlo hasta
21.

Para ver como polimeriza, se le ponen los 4 dntps mientras que, para ver como degrada, se le
ponen 2 ntps. Si le ponemos el primer-template después de desnaturalizarlo, tenemos en el
gel 15 pb. Si lo hibridamos con la polimerasa y ntps:
 - 0 ntps: la polimerasa se come el primer por su actividad exonucleasa. No tiene ntps
para polimerizar. Degrada hasta que quedan 4 dntps.
- 20: empieza a extender pero también sigue degradando
- 100 y 500: se produce la síntesis

Al mutante lo que le ocurre es que no degrada tanto porque cuando no le ponemos dntps no
llega a bajar del todo. En 100 y 500 tienen que poner una mayor [ntps] para que pueda
sintetizar hasta arriba. Con 100 sintetiza mal (no tira ni para delante ni para atrás).

Estos geles son de poliacrilamida para diferenciar DNAs que se diferencian en unas poquitas
bases.

10. Interpreta la siguiente figura donde se muestra el patrón de polimerización de la

polimerasa anterior:

Tenemos un sustrato que cuando extiende el primer completamente tiene 33 mer. Tenemos
[polimerasa].

En la wt puede polimerizar hasta el final hasta que se baja la concentración demasiado. Sin
embargo, en la mutante no llega a extender 33 pb a altas concentraciones. Esto puede deberse
a que pierde la procesividad (se cae antes la polimerasa)  es por ello, por lo que vemos cosas
intermedias. Si fuera procesiva, no se verían esas bandas, se vería la banda de 15 y la de 33.
También se puede hacer empezando la síntesis de DNA y uniendo algo que secuestre DNA
(heparina u otro DNA que no esté marcado). La DNA poco procesiva, cuando se suelte, se va a
unir a otra cosa y va a dejar de sintetizar y la procesiva no se va a soltar nunca.

11. Interpreta la siguiente figura donde se estudia la capacidad de unión de una

polimerasa al DNA:

Es un gel de retarding que sirve para estudiar la unión de una proteína a DNA (no
desnaturalizamos). Si lo tenemos libre, vamos a ver cómo corre abajo del todo. Según se une la
polimerasa, la banda se desplaza hacia arriba (el DNA no corre tanto porque pesa más).

En el mutante, la polimerasa se une peor al DNA porque no se ve que haya un complejo del
mismo tamaño pol-DNA (se suelta, se ven bandas intermedias…etc.).

También se puede utilizar para factores de transcripción que se unan al promotor o para la
RNApol entre otras cosas.

TEMA 2. REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

2.1 Semejanzas y diferencias con la replicación del DNA bacteriana

Semejanzas con procariotas:

- Semiconservativa
- Bidireccional
 - Semidiscontinua
- Mecanismo general

Diferencias con procariotas:

- Velocidad menor (60 kb/min)

- Múltiples orígenes de replicación (en cada ciclo se activan 30000 – 50000 orígenes de
replicación)
- Rondas no solapadas
- Fragmentos de Okazaki más cortos
- Control más complejo

Las proteínas de replicación están conservadas en la evolución, es decir, cada una de las
proteínas de procariotas, tienen su equivalente en eucariotas. Sin embargo, la polimerasa que
lleva la leading es la  mientras que la lagging es la .

En este caso, el primer es un trozo de RNA y otro de DNA y es sintetizado por la DNA pol α/
primasa  también hay que quitar el primer al final.

Stillman y Kelly llevaron una replicación eucariota in vitro (los

primeros) extrayendo en un tubo el DNA SV40 (virus con DNA
sencillo, circular de doble cadena), extractos celulares, Ag T
purificado. SV40 utiliza para su replicación todas las proteínas
de la célula menos la proteína iniciadora y la helicasa (large T
antigen).

Utilizando el test de complementación consiguieron identificar muchas de las proteínas

implicadas en la replicación de mamíferos. Muchas veces el estudio se hace con virus porque
tiene las mismas proteínas.

En eucariotas hay tres polimerasas esenciales para la

replicación:

- DNA polimerasa α/primasa: inicia la síntesis del

primer (en las dos cadenas de DNA) formado por
10 bases de RNA y 20-30 bases de DNA. Tiene
varias subunidades y dos de ellas tienen actividad
 RNApol con la que va a sintetizar la primera parte del primer y otra subunidad tiene
actividad DNApol con la que va a sintetizar la segunda parte. Sin embargo, no tiene
actividad exonucleasa por lo que va a cometer muchos errores (por eso hay que quitar
tanto la parte de RNA como de DNA porque son poco fieles).
- DNA polimerasa : elonga la cadena de síntesis continua.
- DNA polimerasa : elonga la cadena de síntesis discontinua.

PCNA: factor de procesividad y marcador de proliferación. Proliferating cell

nuclear antigen  es un anticuerpo que se une a un antígeno que se unía a
las células que estaban en proliferación. Se descubrió que el antígeno al
que se unía era la pinza deslizante.

El origen de replicación en eucariotas

- En el virus SV40 (b) tenemos una zona que es a la izquierda (zonas azules) que es por
donde se va a abrir el DNA (la helicasa). Las zonas amarillas son donde se une la
proteína iniciadora.
- En S. cerevisiae (c) ocurre lo mismo. Por tanto, en levaduras y virus tenemos la misma
estructura modular que en bacterias. Esas secuencias son ARS (origen de replicación
de levaduras).
- En eucariotas (a) superiores
no hay ninguna secuencia
similar.

Orígenes de replicación en
eucariotas superiores
No hay una secuencia que caracterice los orígenes de replicación en eucariotas superiores
(~50000). Hay otras características que se han descrito en orígenes de replicación, pero no en
todos los orígenes:

- Zonas libres de nucleosomas (nucleosome free regions, NFRs)

- Hélices cuádruples (G4)
- Modificaciones de cromatina. Las colas de las histonas modificadas sirven para que se
unan otras proteínas al DNA.

Las hélices cuádruples y las modificaciones de

cromatina favorecen la formación de NFRs y/o
reclutan factores implicados en la activación del
origen.

Los orígenes de replicación se activan de forma

ordenada.

En cada origen, la replicación es bidireccional, pero

como hay varios orígenes, no todos de ellos se
inician y funcionan igual. Por ejemplo aquí se inicia la
replicación solo en el 1 y 2, en el 3 más tarde y en el
4 ni se inicia.

Hay algunos orígenes que siempre se van a activar

(son constitutivos) como el 6 en este caso. Hay
algunos que están dormidos y que se activan en condiciones como el estrés. No se sabe como
está regulada la activación de estos orígenes.

- Unidad de replicación: contiene varios orígenes de replicación potenciales, pero solo

se activa uno de ellos (interferencia negativa).
- Cluster de replicación: las unidades de replicación se organizan en clusters. En estos
clusters los orígenes de cada unidad de replicación se disparan a la vez (interferencia
positiva).

Los orígenes están

agrupados  cada una de
las partes es una unidad
de replicación
(en cada una de ellas, solo
se activa un origen de
replicación y todos los que
se activan se van a juntar
 cluster de replicación).
2.2 Iniciación de la replicación en eucariotas

En eucariotas, el DNA no está desnudo, está recubierto de nucleosomas, proteínas e histonas.

En eucariotas, primero se unen las proteínas y luego se activan. El inicio de la replicación, por
tanto, ocurre en dos pasos en diferentes fases del ciclo celular:

- Selección del origen de replicación: proceso en el que se identifican los orígenes de

replicación, dirigirán la iniciación de la replicación y se ensambla del complejo pre-
replicativo. Se da en la fase G1 del ciclo celular. En esta fase se unen las proteínas
iniciadoras y la helicasa; sin embargo, no se activan.
- Activación de los orígenes de replicación: Activación del complejo prereplicativo e
inicio de la polimerización (apertura de la doble hélice y comienzo de la replicación por
la polimerasa). Se da en la fase S del ciclo celular.

Esta es la única manera de que no haya solapamiento y que sólo pueda haber replicación en la
fase S. Acabada la replicación en S, no se puede empezar la replicación hasta que no se vuelva
a dar la fase G1.

En procariotas la selección del origen de replicación estaba acoplada a la apertura de la doble

hélice y el comienzo de la replicación.

¿Por qué se da la iniciación en dos fases del ciclo celular?

Porque deben existir controles para que:

- sólo se dé replicación en fase S: no haya solapamiento de rondas de replicación.

- haya acoplamiento entre la división celular y la fase
S.
- mantenga el patrón de activación de los orígenes.
- se inhiban las reiniciaciones.

Cuando se entra en mitosis, se desintegra la membrana

porque debajo de la membrana nuclear hay unas proteínas
que le dan estabilidad y las quinasas dependientes de
ciclinas, fosforilan a estas proteínas y por ello se
desensambla. Es por ello, por lo que la aparición de las quinasas dependientes de ciclinas, son
las que se encargan de pasar de un ciclo a otro.

Proteína iniciadora de la replicación en eucariotas

La equivalente a la DnaA es la ORC

(Origin Recognition Complex):

- ORC es un hexámero, un
complejo de 6 proteínas
- En ARS reconoce los elementos A
y B1
- Al igual que DnaA, une e hidroliza
ATP, y es necesario para reclutar
otras proteínas que participan en
el inicio de la replicación, pero no
participa en la apertura de la doble hélice.

Ensamblaje del complejo pre-replicativo en

fase G1

- El ensamblaje del complejo pre-

replicativo es un proceso ordenado
que se da en G1 y se inicia con el
reconocimiento del origen de
replicación por ORC.
- ORC recluta a los cargadores de la
helicasa, CDC6 y CDT1. Estos
factores cargan la helicasa MCM2-7
(minichromosome maintenance
protein) en el origen de replicación.
- MCM9 coopera con CDT1 para unir
MCM2-7
- MCM2-7 se carga en el dsDNA, pero
no se activa, eso solo ocurre
cuando se entra en fase S.

Complejo de prereplicación  para que se active necesitamos que se den unas fosforilaciones
gracias a las ciclinas  esto ocurre en la fase S que ahora explicaremos.

La geminina inhibe a CDT1 (solo existe en fases que no son G1).

Activación del complejo pre-replicativo en fase
S

- Al entrar en fase S se activan la quinasa

CDK (cycline-dependent kinase).
- Se inactivan los cargadores de la
helicasa. CDC6 se fosforila, se ubiquitina
y se degrada. CDT1 es inhibido por
Geminin (proteína ausente en fase G1 y
presente en fases S, G2 y M). En
presencia de CDK, CDC6 y CDT1 no
entran en el núcleo luego no se puede
volver a formar el complejo
prereplicativo.
- Con la activación de CDK se unen al
origen otras proteínas importantes para
el inicio de la replicación: DDK (Dbf4-
dependent kinase, compuesta de CDC7 y
DBF4), CDC45, RPA, GINS y otras.
- La actividad de DDK es necesaria para la unión de CDC45 y RPA a los orígenes. RPA
recluta a la primasa y CDC45 a las polimerasas. CDC45 y GINS activa la helicasa y
forman un complejo con ella iniciando así la replicación.

Al final, en G1, se carga el complejo prerreplicativo,. En S se activa la helicasa y comienza la

replicación. En G2 y M no pasa nada.

La replicación está acoplada al ciclo celular y controlada por las CDKS .

- Durante la fase G1 se puede cargar la helicasa pero está bloqueada su activación.

- En el resto de las fases del ciclo celular (S, G2 y M) está inhibida la carga de la helicasa,
pero las helicasas cargadas se pueden activar. Esto solo ocurre en fase S porque tras la
fase S los complejos Mcm 2-7 se liberan del DNA.
La formación y la activación del complejo pre-replicativo está controlado por las Cdks. Estas
tienen dos funciones:

- Se requieren para activar las helicasas cargadas e iniciar la replicación en S.

- Inhiben la carga de las helicasas en S, G2 y M.

Prevención de la reiniciación de la replicación:

Para prevenir la re-replicación, las células han

desarrollado diversos mecanismos para regular
específicamente los orígenes que hayan sido
activados mediante 3 mecanismos:

1. La proteína enrollada geminina es un

factor clave para restringir el origen de
restablecimiento, una vez que la
replicación ha sido iniciada. Actúa
uniéndose directamente a CDT1 para
inhibir su actividad.
2. La fosforilación (principalmente mediada
por las quinasas dependientes de ciclinas)
de componentes pre-RC (CDC6, MCM,
ORC1 y CDT1) participa en la represión de
la reactivación de orígenes.
3. El complejo ubiquitina-proteosoma
contribuye a la regulación una vez la
célula ha entrado en la fase S.

Durante cada ciclo solo hay una oportunidad de formar pre-RC, cuando niveles de CDK son
bajos (durante G1).
Complejo de replicación en eucariotas

¿Cómo se unen los fragmentos de Okazaki en

eucariotas?

- En la opción de la izquierda (i), tenemos los

primers a los que hay que quitar enteros.
Quien quita el primer es una RNAsa que
quita casi todo y luego hay una exonucleasa
que quita el resto que le queda. Luego se
extiende por una polimerasa que rellena el
hueco y se unirá por una ligasa.
La polimerasa  es capaz de desplazar la
banda. Coge el extremo 3´OH y lo extiende,
desplazando al DNA que tiene delante (eso
es el FLAP  Fen es una FLAP endonuclease
 es capaz de cortar y eliminar las
secuencias desplazadas, que después serán
unidas por la ligasa).
- En la opción del medio (ii) denominada la vía
del FLAP largo  Los cebadores de ARN-
ADN primero son desplazados por pol δ
mediada síntesis de ADN por
desplazamiento y posteriormente generan
largas estructuras FLAP que están recubiertas por RPA. Dna2 primero viene a dividir los
FLAPS largos, que dejando así un FLAP de 5-7 nt. Entonces Fen1 escinde los FLAPS
cortos restantes para generar nicks ligables.
 - Por último, en la vía del FLAP corto (iii)  la pol δ mediada síntesis de ADN por
desplazamiento creando un FLAP corto. Este FLAP corto es partido por Fen1. Después
de unos cuantos ciclos, el primer de RNA-DNA es retirado por completo.

Resumen de procariotas y eucariotas

El problema de la replicación de los extremos de DNAs lineales

Debido a la síntesis incompleta de la lagging strand,

se produce un acortamiento de aproximadamente
50 pb/división. El último fragmento de Okazaki deja
un extremo 3´protuberante.

En la lagging strand, cuando la maquinaria de

replicación llega al final del cromosoma, la primasa
no tiene suficiente espacio para sintetizar un nuevo
cebador de ARN. Esto da como resultado una
replicación incompleta. y una región ssDNA corta en
el extremo 3' del producto de ADN de lagging
strand. Cuando este producto se replica en la
siguiente ronda, uno de los dos productos se
acortará y carecerán de la región que no fue copiada
completamente en el anterior ronda de replicación.
Algunos DNAs lineales utilizan una proteína como primer. Hay DNAs lineales de algunos fagos
(29), plásmidos, bacterias (Streptomyces) y virus (Adenovirus) que han solucionado este
problema utilizando como primer una proteína. La bolita azul tiene un residuo que tiene un OH
y está unido a la polimerasa; esta última va elongando hasta que queda un DNA con una
proteína unida (no tienen esos primers y por lo tanto problemas con el DNA suelto).

2.4 Mecanismo de replicación de los telómeros: telomerasa

Los telómeros son necesarios para la estabilidad de los extremos de los cromosomas. Protegen
a los cromosomas de degradación o fusiones inespecíficas.

El DNA telomérico está formado por secuencias cortas repetidas en tándem. El acortamiento
de los telómeros está ligado a la división celular. La enzima que contrarresta ese acortamiento
se denomina telomerasa.

Si los quitas los telómeros, los cromosomas se vuelven inestables y pegadizos (se fusionan
unos con otros).

Tipos de extremos:

- Extremos romos  los extremos acaban en el mismo sitio

- Extremo recesivos  extremo más corto con respecto al otro
 - Extremo protuberante  extremo más largo con respecto al otro

En los telómeros hay extremos 3´protuberantes (sobresale el extremo 3´sobre el 5´) de

alrededor 14-16 bases de ssDNA  por lo tanto la polimerasa no puede extenderlo.

Los télomeros están formados por repeticiones terminales cortas ricas en TG. Se ajusta a la
fórmula 5’-(T/A)nGm-3’ donde n va de 1 a 4 y m es mayor de 1.

Las repeticiones dependen del organismo que estemos tratando.

Estructura del telómero

- La estabilidad de los extremos del cromosoma es debida a la

formación de un bucle de DNA en el telómero llamado t-loop.
- El tamaño medio del t-loop en mamíferos es de 5 a 10 kb.
- Se forma cuando el extremo 3’ del telómero desplaza una región
similar upstream y se hibrida con su homólogo.
- La formación del t-loop está catalizada por la proteína de unión
al telómero TRF2.

El DNA es peligroso tenerlo suelto con ese extremo 3´. En el extremo del telómero se forma un
loop porque el extremo 3´ hibrida con una zona de la cadena (esto se debe a las secuencias
repetidas) y así se protege.

Hay un complejo denominado shelterin que protege a los telómeros (como hay cadena
sencilla, las proteínas de reparación podrían querer repararlo).

En mamíferos, hay 6 proteínas teloméricas (no hay que saberse los nombres) que forman el
complejo shelterin. Este complejo tiene como funciones principales proteger a los telómeros
de los sistemas de reparación celulares, regular el largo de los telómeros y reclutar a la
telomerasa (TPP1).

El

DNA de la telomerasa está siempre está condensado (no se va a transcribir porque no pueden
acceder las proteínas). La zona más oscura de los cromosomas es heterocromatina y la más
clara es la eucromatina que sí que se expresa porque está menos condensada. Dentro de ellos,
los telómeros están tan condensados como los centrómeros por eso se denomina
heterocromatina constitutiva; las facultativas podrían llegar a transcribirse.
La telomerasa es una DNA polimerasa que utiliza como molde
RNA  retrotranscriptasa (DNA polimerasa RNA
dependiente).

La parte denominada TERT es la parte de la actividad

polimerasa (sintetiza DNA telómerico de novo) y TERC es un
molde que lleva con ella.

Blackbum, Greider y Szoskat descubrieron el complejo de la

telomerasa, las proteínas accesorias…

María Blasco trabajaba con las telomerasas g-29 y participó en

experimentos de clonaje.

La telomerasa extiende más todavía el extremo protuberante. El molde de RNA que lleva, es
complementario a la secuencia del telómero. Pone su molde hibridado con el DNA y sintetiza
todo lo que le queda y se desplaza para extender el extremo. De esta manera consigue dejar el
espacio suficiente para que pueda haber un primer (que luego se tendrá que quitar) y un
fragmento de Okazaki. De esta manera consigue que siga habiendo un extremo 3
´protuberante pero más extendido que antes.

La telomerasa extiende los telómeros hasta un punto  las shelterinas lo regulan. Este
complejo tiene proteínas que inhiben la acción de la telomerasa, la bloquean. Si es muy corto,
las proteínas que hay son insuficientes para parar la actividad de la telomerasa por lo que
extiende. Si es largo, el complejo es tan grande que no
puede extender más.

- Células que no
expresan
telomerasa: se
pierden las
repeticiones de los telómeros durante la división
celular. Cuando los telómeros alcanzan una cierta
longitud, se envía una señal iniciar un programa de
senescencia celular. Límite Hayflick  el
máximo número de veces que se puede dividir una
célula sin telomerasa.
- Células con telomerasa: en cepas celulares
que se ven obligadas a hacer telomerasa por
expresión de hTERT, la longitud de los
telómeros no se acorta (incluso se alarga, pero esto no se muestra). Estas células no
entran en senescencia.

¿En qué células está activa la telomerasa?

Hay telomerasa en las células madre, germinales y tumorales, NUNCA en las somáticas. Las
germinales mantienen el tamaño de sus telómeros toda la vida.

Se ha relacionado mucho la telomerasa con el

envejecimiento. Se han hecho mutantes con telomerasa
activada que no tienen más cáncer. También existen
animales que tienen siempre la telomerasa activa. Por
tanto, hay gente que propone activar la telomerasa con el
fin de vivir mejor; sin embargo, esto está prohibido.
Existen ensayos donde te meten un adenovirus asociado y
activan la telomerasa para en teoría vivir mejor.

2.5 Estrés replicativo: regiones de difícil replicación

Hay problemas que causan estrés: que se formen estructuras secundarias o hélices cuádruples
 cómo solución, las topoisomerasas o helicasas lo pueden deshacer. También se puede
formar un Loop-R donde se junta DNA con RNA (hay enzimas y RNAsas que lo deshacen).
Daños y roturas en el DNA bloquean la replicación  es grave porque puede llevar a una
rotura de doble cadena del DNA (es complicado solucionarlo y es peligroso). Cuando se rompe
ssDNA se puede remendar con la otra cadena, pero cuando se te rompen las dos ya es más
grave.

Estrés replicativo inducido por oncogenes

En cáncer lo que puede pasar es que un oncogen que se activa:

1. No se disparen los orígenes de replicación

2. Que se disparen más los orígenes de replicación

Los cargadores de helicasa están solo en la fase G1 como habíamos visto, si las ciclinas y
quinasas se desregulan por un oncogen por ejemplo, podrían llegar a activarse en fases donde
no deberían (S). Así se podría iniciar la replicación en momentos y lugares donde no debería
darse.

El bloqueo de la replicación dispara DDR (DNA damage response)

Cuando se bloquea la replicación de DNA,

lo que principalmente va a suceder es que
se bloquee la horquilla de replicación
porque se encuentra DNA de cadena
sencilla (que si hay mucho es un
problema) o con roturas de cadena doble
 se activa la respuesta al daño DDR
(siempre que hay daño se activa)  son
quinasas que cuando se activan van a
activar los sistemas de reparación, van a
bloquear el ciclo celular, van a activar a la
P53. Además ATM fosforila la histona H2A de los nucleosomas  chivato para los sistemas de
reparación (saben que hay una rotura de doble cadena).
La pérdida de los telómeros también activa la DDR (DNA damage response)

Cuando los telómeros se pierden (cromosomas con las puntas amarillas)  la célula también
activa el sistema DDR y la célula para y entra en apoptosis.

Crisis telomérica y cáncer

En cáncer el sistema de reparación o los chivatos no funcionan (se ha podido perder p53 por
ejemplo)  los cromosomas sin telómeros siguen en marcha  la telomerasa se vuelve a
activar. Una consecuencia es que se originen cromosomas con 2 centrómeros (cromosomas
discéntricos)

En última instancia, la reactivación de la telomerasa proporciona una ruta para salir de la crisis
de los telómeros al sanar críticamente los telómeros acortados y mejorando la estabilidad
genómica (aumentando así la viabilidad celular). El tumor resultante tendrá la telomerasa
activa y un genoma muy reorganizado.

2.6 Ensamblaje de los nucleosomas tras la

replicación

Los nucleosomas se ensamblan inmediatamente

después de la replicación.
Tras una serie de experimentos se llegó a la conclusión que, cuando se replica, el DNA nuevo
esta formado por una mezcla de nucleosomas antiguos y nuevos.

El DNA que se está replicando tendrá unas marcas epigenéticas  tendrá unos nucleosomas
con unas histonas con unas modificaciones. Esa información hay que meterla en el DNA hijo.
Hay unas histonas que tienen una modificación que puede ser una acetilación. Si esas
acetilaciones están en los antiguos, va a
haber unas proteínas que van a acetilar a
los que tienen al lado, consiguiendo tener
todos los que hay alrededor acetilados
como estaban en el DNA inicial. Todo el
DNA recién sintetizado debe tener las
mismas marcas epigenéticas que el DNA de
origen.

A medida que el cromosoma se replica, las

histonas asociadas con el cromosoma de los
padres se reparten. El tetrámero de
histonas H3.H4 se transfiere
aleatoriamente a una de las dos hebras
hijas pero no entra en la piscina soluble de tetrámeros H3.H4. Los tetrámeros H3.H4 recién
sintetizados, forman la base de los nucleosomas en la hebra que no hereda el tetrámero
parental. Por el contrario, los dímeros H2A y H2B son liberados en la piscina soluble y
compiten por la asociación H3 H4 con H2A y H2B recién sintetizados. Como consecuencia de
este tipo de distribución, en promedio, cada segundo, un tetrámero H3.H4 es sintetizado
derivado del cromosoma parental. Estos tetrámeros incluyen todas las modificaciones
añadidas a los nucleosomas parentales. Lo más probable es que los dímeros de H2A.H2B sean
derivados de proteína recién sintetizada.

Las modificaciones de las histonas se mantienen en los nuevos nucleosomas.

A medida que se replica un cromosoma, la distribución de

los tetrámeros H3.H4 parentales resulta en una hija de
cromosomas que reciben las mismas modificaciones que
el padre. La capacidad de estas modificaciones para
reclutar enzimas que realicen lo mismo modificaciones
facilita la propagación de la modificación a las dos hijas
cromosomas. Por simplicidad, la acetilación se muestra en
las regiones centrales de las histonas (no en las colas
amino/terminales).

La banderita significa acetilación  si la banderita está en

los DNA antiguos, las zonas de al lado también se acetilan.

Factores de ensamblaje de nucleosomas: chaperonas de

histonas

Las chaperonas-histonas son las que dan lugar a los

nucleosomas. Estas se unen a la pinza deslizante (chivato
que va diciendo dónde se está sintetizando el DNA, allá donde se sintetice y se necesite alguna
proteína, esta se unirá a la pinza y ella le llevará hasta el DNA sintetizado a la que se le va
colgando esta y va colocando las histonas donde deberían)  une las histonas antiguas y las
coloca en el nuevo (como no hay suficientes antiguas para el nuevo, se ponen nuevas histonas
rellenando así los huecos). A la pinza deslizante también se le unen las proteínas de reparación
a parte de la polimerasa.

Preguntas del foro:

Aquí se estudia la enzima wt (phi29 DNAP) y unas proteínas de fusión en las que se ha
añadido el dominio de unión de una topoisomerasa a la enzima wt (29-H y 29-HI).

Es un gel de retardo. Los mutantes se unen mejor que la wt porque retarda mucho más que lo
que hace la wt. Mejoraron la topoisomerasa para que se uniera mejor el dna.

Aquí tenéis un experimento realizado con una polimerasa wt y diversos mutantes. ¿Sabríais
decir qué tipo de experimento es? ¿Y cuáles son las conclusiones de este experimento?
En el otro experimento, también es un gel de retardo (poliacrilamida muy diluida con un
porcentaje muy bajo).

Cuando se une el DNA con la proteína, es cuando sale banda arriba (ha formado el complejo).
S, F, K son mutaciones dirigidas cambiando residuos.
 TEMA 3. REPARACIÓN DEL DNA

3.1 Causas y tipos de daños producidos en el DNA e implicaciones biológicas de los sistemas
de reparación

Existen diferentes daños que pueden estar presentes en el DNA (estos pueden estar
producidos por una multitud de causas diferentes. Algunos ejemplos son:

Intracatenario significa que el error se encuentra en la misma cadena e intercatenario es entre

las dos hebras.

Estos errores se producen habitualmente (10000 veces en cada célula por día) y
espontáneamente, por lo que hay que arreglarlos.

Estos cambios/ mutaciones pueden producir:

- Cambios en una base: puede ser un cambio de base o una base modificada. Afectan a
la secuencia de DNA pero no distorsionan mucho la estructura. Las consecuencias de
estos cambios son los cambios que provoca el cambio de secuencia, no suelen afectar
a la replicación o transcripción.
- Distorsiones estructurales: son impedimentos para la replicación y la transcripción,
como la formación de dímeros, la metilación de bases, etc.
- Roturas de DNA: pueden ocurrir en una cadena o en las dos. Una rotura en una de las
cadenas, como un nick, se puede reparar fácilmente. Una rotura de doble cadena
(DSB) si no se repara puede dar lugar a pérdida de DNA.

Mecanismos de reparación del DNA

Para compensar el daño que se produce en el DNA, las células han desarrollado varios
mecanismos de reparación que corrigen diferentes tipos de lesiones en el DNA:

1. Reparación directa: revierten el daño en el DNA directamente. Si hay

una metilación, por ejemplo, existe una enzima que quita este metilo.
 2. Sistemas de reparación por escisión: BER (se escinde una base) y NER (se escinde un
nucleótido).

3. Reparación de bases mal apareadas: MMR  va

asociado a la polimerasa detrás de ella. Es
postreplicativo.
4. Reparación de roturas de doble cadena: HR y NHEJ
5. Síntesis translesiva o bypass

3.2 Reparación directa

Reparación directa: se reparan bases de DNA dañadas, O 6-

alquilguanina o dímeros de ciclobutano de pirimidina, con una
reacción enzimática que restaura la estructura original. Si hay una
base dañada, se hace el inverso para repararla.

La radiación UV (100 – 400 nm) es absorbida por las bases y una

de las consecuencias es la fusión de dos pirimidinas adyacentes
en la cadena polinucleotídica. En el caso de dos timinas
adyacentes la fusión se llama dímeros de timina, se forma un
anillo de ciclobutano entre los átomos 5 y 6 de las timinas.

Lo más común es cuando se forman dímeros de timina por la luz

UV, que no solo tenemos la unión entre el esqueleto azúcar
fosfato, sino que se forma una distorsión que hace que no se
pueda llevar a cabo la replicación. La fotoliasa se activa con la luz
visible y puede cortar los enlaces que hay en las timinas para
revertir esa unión que estaba funcionando mal (este proceso se
denomina fotoreactivación). Nosotros y todos aquellos
mamíferos que sean placentarios, no tenemos esta enzima (hay bacterias y otros

microorganismos que sí)

Dealquilación

Por otro lado, la O6-metil guanina DNA metil transferasa puede eliminar grupos metilo de O 6 de
la guanina, transfiriéndolo a sus propios residuos de cisteína. La O 6-
metil-guanina forma complementariedad de base con una timina
en vez de una citosina.
Por lo tanto, esta enzima quita el grupo metilo que se ha añadido a una guanina, dejando así
que funcione. Los agentes alquilantes son compuestos reactivos que pueden transferir grupos
metilo, etilos u otros alquilos al DNA.

3.3 Sistemas de reparación por escisión de bases (BER) y

nucleótidos (NER)

Los dos funcionan de la misma manera:

1. Incisión: la estructura dañada es reconocida por una

endonucleasa que corta el DNA.
2. Escisión: una exonucleasa elimina el DNA dañado. Puede ser
que una helicasa desplace el DNA dañado y se degrade
posteriormente.
3. Síntesis: la cadena de ssDNA sirve de molde para la síntesis
del DNA que reemplaza el fragmento degradado. La ligasa
sella el nick.

BER: corrige errores que no producen errores de distorsión en la

doble hélice

NER: corrige errores que producen errores de distorsión en la doble hélice

o BER

Actúan corrigiendo lesiones de las

bases que no causan una distorsión
en la doble hélice. Constan de
varios pasos enzimáticos.

- Deaminación,
depurinación, metilación,
etc.
- No provocan cambios
importantes en la
estructura del DNA.
- No afectan a la replicación
y transcripción.

BER en procariotas (E.coli):

1. Eliminación de la base: DNA glicosilasas específicas,

que al actuar dejan un sitio AP (apirínico, o
apirimidínico en este caso). Tenemos una citosina que
ha perdido el grupo amino (uracilo) emparejada con
una guanina (la desaminación de la citosina ocurre de
100 a 500 veces al día). La uracil DNA glicosilasa es una
glicosilasa específica para eliminar uracilos del DNA. La
glicosilasa elimina la base al romper el enlace entre la
 base y el azúcar (no corta la unión azúcar fosfato)  nos queda un sitio abásico (nos
falta una base) debido a que quita el uracilo.
Las glicosilasas van levantando todas las bases chequeando que no sea uracilo (si es la
cortan).

2. Escisión: AP endonucleasa específica, rompe la cadena polinucleotídica en el sitio

abásico (quiten el azúcar fosfato dejando un hueco vacío.)
3. Rellenado y unión: DNA polimerasa I y DNA ligasa, la polimerasa rellena el hueco
tomando como molde la cadena complementaria y la ligasa sella el Nick.

No participan helicasas (sólo lo hacen en NER).

BER en eucariotas:

Hay dos opciones de ruta de BER:

- Short-patch pathway: se remplaza solo 1

nucleótido. Es el mecanismo dominante (99%),
ya que no requiere de proteínas que participen
en la replicación. Es eficiente en proliferación
(pol ) y quiescencia (pol ). Es menos común
porque utiliza proteínas de replicación (solo
ocurre en células en proliferación).
Enzimas necesarias: glicosilasas, AP
endonucleasa APE1, DNA Pol  y DNA ligasa
- Long-patch pathway: se elimina de un mayor
número de nucleotidos (2 - 10). Solo ocurre en
células en proliferación porque requiere de la
maquinaria de replicación (menos común 1%).
Enzimas necesarias: glicosilasas, AP
endonucleasa APE1, PCNA, DNA Pol δ/, FEN1,
DNA ligasa.

o NER

Repara distorsiones en la doble hélice. Se elimina un DNA

que contiene el daño quedando un ssDNA que es utilizado
como molde por polimerasas.

- Elimina lesiones muy diferentes: lesiones

inducidas por UV, entrecruzamientos entre
cadenas, aductos de DNA, lesiones producidas
por ROS… todas las lesiones que causen distorsión
de la doble hélice
- Al haber distorsiones en la doble hélice, afectan a
la replicación y transcripción.

Tenemos un dímero de pirimidinas  las glicosilasas

cortan ambos lados del error de forma asimétrica y luego
una helicasa desplaza ese DNA cortado sacándolo 
queda un hueco que rellena una polimerasa y luego la ligasa. Se da cuando hay una distorsión
en la doble hélice (afecta a la replicación y transcripción).

NER en E.coli

En E.coli hay un grupo de proteínas de reparación  UVR (system for

excision repair) que son sensibles a la luz UV.

a) Un dímero de UvrA y UvrB rastrea el DNA. UVrA detecta

distorsiones en el DNA. UvrA y UvrB se unen a la distorsión en la
doble hélice.
b) UvrA se disocia y UvrB abre el DNA y se crea una burbuja
alrededor de la lesión.
c) Se recluta UvrC. UvrC corta a ambos lados de la lesión de forma
asimétrico, 8 nucleótidos antes y 4b nucleótidos después.
d) Se une una helicasa UvrD que desplaza el ssDNA cortado.
Finalmente la DNA pol I y la ligasa rellenan el gap y cierran el
Nick.

NER en eucariotas

En eucariotas estas son las proteínas XP.

Hay dos vías:

- Global genoma repair (GG-NER): La proteína XPC en complejo

con otras proteínas reconoce daño en cualquier lugar del genoma. Puede actuar em
cualquier momento del ciclo.
- Transcription-couple repair (TC-NER): Se activa cuando la RNA polimerasa II se
bloquea durante la transcripción al encontrarse una lesión. Solo puede actuar
acoplado a la transcripción.

Hay dos proteínas XPB y XPD que forman parte de un factor denominado TFIIH (factor de
iniciación de la transcripción compuesto por dos subunidades de helicasa). En ambos casos se
recluta este factor.

XPF y XPG son endonucleasas que cortan el DNA a ambos lados de la lesion, las helicasas
desplazan el DNA cortado y queda un gap de 22-30 nucleótidos.

Se une el PCNA que recluta a una DNA polimerasa (DNA Pol δ, DNA Pol κ o DNA Pol ε) para
llenar gap, y se cierra el Nick con la ligasa.

Si tenemos una mutación en la proteína XP:

Si te falta una, la mayoría de las veces no tienes el sistema de reparación por escisión de
nucleótidos. Sobre todo es perjudicial en las células que están más puestas a agresiones (ojos,
piel…). Los dímeros de timina y pirimidina forman alteraciones estructurales que no van a
poder ser reparadas.
Un ejemplo de enfermedad debida a estas mutaciones es Xerodema Pigmentosa (XP). Los
enfermos no pueden reparar las lesiones producidas por los UV. Se han identificado
mutaciones en genes del sistema XP (XPA-XPG). Síndrome recesivo autosómico.

3.4 Reparación de bases mal apareadas (MMR)

MMR (mismatch excision repair): repara desapareamientos, inserciones y deleciones que se

detectan tras la replicación.

Actividades de las DNA polimerasas:

- Polimerasa 5’-3’, actividad de síntesis de DNA

- Exonucleasa 3’-5’, actividad de degradación de DNA o proofreading.

La polimerasa comete errores, la tasa de mutación de la actividad 5’- 3’ polimerasa es 10 -5. La

actividad 3’ - 5’ exonucleasa permite disminuir la tasa de mutación a 10 -7. La tasa de mutación
de replicación del genoma es alrededor de 10 10 y esta diferencia se debe a la acción de los
mecanismos de reparación.

Estos errores que mete la polimerasa que hay que

corregirlos porque si no se quedan. Si no se
arregla, cada una de las hebras serán molde para
una nueva replicación  ahí ya no se va a poder
reparar porque no se va a detectar como error.
Por ello hay que corregirlos antes de que tenga
lugar la replicación. Actúa muy coordinado con la
replicación.

Para saber qué hebra hay que reparar es la que no esté metilada.

MMR en E.coli

La proteína Dam metilasa (deoxiadenosina metilasa)

transfiere grupos metilo de moléculas de S-adenosin
metionina a las adeninas de la secuencia GATC.

La Dam metilasa incorpora el grupo metilo dos minutos

después de que le nucleótido ha sido incorporado por lo
que, tras la replicación, el DNA está temporalmente
hemimetilado.

La bacteria aprovecha esta hemimetilación para

diferenciar la cadena parental de la de nueva síntesis.

Las proteínas que actúan en el mismatch repair son las

Mut.

Hay unas proteínas que detectan el desapareamiento de las cadenas (MutS)  reclutan a
otras (MutL) que producen una rotura en la cadena que no está metilada  la helicasa actúa y
una exonucleasa degrada el DNA desplazado  polimerasa  ligasa. Es parecido a los de
escisión pero está asociado con la replicación (si no se está replicando la célula no actúa).

MMR en eucariotas

Hay homologías. Todos los organismos tienen homólogos a MutS y MutL, pero MutH está
presente sólo en E. coli y algunas bacterias gram-negativas.

- hMutSα (MSH2-MSH6) escanean

el DNA y localizan las bases mal
apareadas. Rosa y azul
- hMutLα (MLH1-PMS2) se une y
es activado por el PCNA y corta la
hebra de DNA. Amarillo y
morado

Para saber dónde tienen que unirse está

la pinza deslizante (PCNA) que es la que
recluta las proteínas.

A la vez que se detecta el daño, se está produciendo la replicación. Cuando encuentra el daño
se reclutan unas proteínas que cortan al lado del daño  el PCNA les indica dónde tienen que
cortar. Se rellena el sitio y se liga.

Una enfermedad producida por esto es el cáncer colorrectar hereditario no polipósico. Se

caracteriza por la inestabilidad de microsatélites: el número de bases repetidas del DNA en un
microsatélite (secuencia de DNA corta y repetida) es diferente del número que se heredó →
fragilidad cromosómica.
 3.5 Mecanismos de reparación de roturas de doble cadena en el DNA (DSB) en
eucariotas:

Los DBS en el DNA son los daños más peligrosos para la célula porque se rompe un dsDNA
entero. Si no se repara, la porción de cromosoma sin centrómero no se segregará en la
siguiente división celular.

DSBs se pueden generar por radiación ionizante, radicales libres, endonucleasas, o durante la
replicación. El encuentro de una horquilla de replicación con una lesión en una de las cadenas
del DNA puede dar lugar a un DSB.

Se pueden reparar por:

- Homology-directed recombination-repair or homologous recombination, HHR or HR.

HHR tiene lugar solo después de la replicación, al final de la fase S y en la fase G2 del
ciclo celular, ya que necesita la cromátida hermana para actuar como molde. También
está implicada en procesos fisiológicos como la recombinación meiótica o el
mantenimiento de los telómeros.
- Nonhomologous end-joining, NHEJ. En este caso no se utiliza molde para la
reparación, por ello introduce muchos errores (error-prone) y es independiente del
ciclo celular.

Si tenemos una cromátida hermana vamos a

tener la información que nos falta en la otra 
se puede hacer una recombinación homóloga.

Si estamos en una fase del ciclo en la que no hay

cromátida hermana  hace lo que sea para unir
esos rotos de DNA (aunque desencadene errores
o pierda información). Modifica los extremos
quitando o añadiendo nts para poder unirlos 
error prone (es mejor para la célula tener un DNA
con errores que roto). Por ejemplo, el problema
con el sistema de CRIPR cas es que en la edición
génica produce roturas.

En el sistema de la izquierda  en los que no tienen homología, descubrieron que hay 3

sistemas, se diferencian en el grado de homología de los extremos que quedan. Todos
provocan errores (son error prone). El más efectivo es el que utiliza el SSA (mete menos
errores).

- Nonhomologous end-joining, NHEJ. Mecanismo error-prone que funciona cuando no

hay homología o una homología de solo 1-4 nucleótidos.
- Single-strand annealing (SSA). Mecanismo error-prone que funciona en secuencias
repetidas y requiere una homología de 20 nucleótidos.
- Alternative or Microhomology-Mediated End Joining (alt-EJ ó MMEJ). Mecanismo
error-prone que requiere pequeñas microhomologías de 1 - 16 nucleótidos.

3.6 Reparación translesiva o bypass (TLS)

Síntesis translesiva o bypass: realizado por polimerasas

bypass o TLS, permite a las células seguir funcionando en
presencia de lesiones que normalmente bloquearían la
replicación.

Hay un dímero de timina  llega la polimerasa con la

pinza deslizante y se para porque no puede seguir
sintetizando (cuando se para es un problema  se
produce una rotura de doble cadena si los sistemas de
replicación no lo reparan). Pasan a través de la lesión las
polimerasas bypass (no tienen un centro activo fiel) pero
acomodan el dímero permitiendo a las células seguir
funcionando en presencia de lesiones que normalmente
bloquearían la replicación. Si hay polimerasa translesiva
ha metido un error y ha seguido sintetizando. Si no hay, se produce una rotura del cromosoma.
Por eso es mejor que actúen las polimerasas bypass aunque produzcan error, a que se rompa
el cromosoma.

DinB y UmuD’2C son DNA polimerasas TLS (translesion synthesis)  DNA polimerasas de
emergencia que replican zonas dañadas.

En eucariotas el PCNA se modifica químicamente cuando se encuentra una lesión, se

ubiquitina, lo que es una señal para que entren las polimerasas TLS.
 3.7 Reparación inducida

Cuando ocurre un daño en una célula, reparar la lesión es sólo parte de la respuesta al daño.
Tras el daño en el DNA se activa una respuesta multigénica. Esta ruta existe en procariotas y
eucariotas.

Cuando se detecta daño en el DNA en procariotas:

- Se bloquea la división celular. Paramos para ver qué pasa antes de seguir.
- Se activa la respuesta SOS, donde se activa la transcripción de varios genes, algunas
proteínas de reparación. Por ejemplo, se activan las polimerasas bypass. El sistema
SOS activa la proteína RecA que está implicada en la recombinación homóloga. Esta
tiene actividad proteasa y degrada a LexA (impedía la transcripción de genes que
bloquean la división bacteriana). Es por ello por lo que estas proteínas se van a
expresar para bloquear la división.
- Se activan los profagos lisogénicos.

Cuando se detecta daño en el DNA en eucariotas:

- Se activan los check points del ciclo celular hasta que el daño se repara.
- Se producen cambios transcripcionales que facilitan la reparación del daño (como la
síntesis de proteínas de reparación).

En eucariotas cuando hay muchos errores en DNA se activa ruta de señalización DDR, esa ruta
de reparación inducida induce la aparición de proteínas para reparación, existe en procariotas y
eucariotas. Se activan kinasas atn y/o atr (en cascada), y también otras kinasas que llevaban
primero a bloqueo del ciclo celular  se activan proteínas de sistema de reparación y
relacionadas. Por ejemplo p53.

Reparación inducida en E. coli, respuesta SOS

LexA bloquea la síntesis de estas proteínas incluyendo RecA (se sintetiza un poco). Cuando hay
un daño, RecA se une al ssDNA libre y por lo tanto se dejan de reprimir la síntesis de proteínas
como:

- Genes relacionados con proteínas implicadas en reparación, como uvrA, uvrB y uvrD.
- Genes relacionados con proteínas implicadas en recombinación, como recA.
- Genes relacionados con polimerasas bypass y polimerasas de reparación.
- Genes relacionados con proteínas implicadas en parada de la división celular.
- Genes relacionados con proteínas implicadas en inducción de lisógenos.
LexA es un represor de la transcripción que controla la expresión de los genes implicados en la
respuesta SOS.

Si hay muchas mutaciones en la célula RecA se une a ssDNA y estimula la proteólisis de LexA
(actúa como co-proteasa para activar la actividad proteasa del C-terminal de LexA), lo que
permite la expresión del operón. RecA también estimula la proteólisis de UmuD (precursor
inactivo de UmuD’).

Reparación inducida en eucariotas

DDR es una ruta de señalización que detecta el daño en el DNA y el estrés replicativo y dispara
una respuesta para proteger la célula y mitigar el daño.

- En presencia de daño celular p53 se estabiliza (porque MDM2 se fosforila y ya no

puede degradar p53).
- Aumentan los niveles de p53.
- p53 es un factor de
transcripción que active unos
genes y reprime otros.
Reparación DNA en eucariotas y cromatina

Si el DNA está con nucleosomas, no pueden acceder las

proteínas para repararlo  se da una remodelación de la
cromatina para que los nucleosomas que estén donde el error,
se vayan moviendo. Una vez se haya reparado el error,
vuelven a su sitio.

La cromatina es un obstáculo para la reparación del DNA, por

lo que debe ser modificada y remodelada antes o durante la
reparación, y después volver a modificarse para volver al
estado original.

Las modificaciones más habituales en los histonas de dsDNA

encontramos H2AX  tiene unas acetilaciones en residuos
concretos, 2 fosforilaciones y una ubiquitinación.

Perfil de modificaciones de 4
histonas:

Con otro tipo de daños:

Hay un código de histonas que indican cosas, por ejemplo una rotura de doble cadena.

Una rotura de doble cadena  se ha visto las marcas que hay a diferentes tiempo  van
cambiando porque se van reclutando proteínas diferentes. Las modificaciones de las histonas
marcan diferentes zonas del DNA, están muy conservadas en muchos organismos ya que son
muy importantes.

Cuestiones de reparación:

1. Se ha demostrado recientemente que proteínas eucarióticas implicadas en el

proceso de reparación de desapareamientos interaccionan con PCNA. ¿Cuál puede
ser el significado biológico de este resultado?

PCNA → pinza deslizante → factor de procesividad y marcador de proliferación → tiene 3 subud.

PCNA es la pinza deslizante de eucariotas; un factor de procesividad y

marcador de proliferación que tiene 3 subunidades. Lleva proteínas de
reparación, además de cargador de histonas.

Sirve para que estén localizados en la hebra de nueva síntesis y para colocar dónde se está
sintetizando el DNA. Orienta a las proteínas para que el centro catalítico que corta el DNA esté
en la hebra de nueva síntesis. Aquí no cuenta la metilación, sino la unión con el
PCNA.

-Coordina la reparación de DNA: funciona como pinza deslizante que se une

al DNA en la replicación facilitando la acción de las enzimas implicadas en la
síntesis y reparación de DNA.De esta forma PCNA puede estar involucrada en
estos procesos.
-Mejora la eficacia de reparación al reclutar las proteínas de reparación
correctas al sitio dañado del DNA ( acelerar y facilitar la corrección de
errores).

-Regula la reparación y replicación por la interacción de PCNA y las

proteínas de reparación de desapareamientos.

-Respuesta a estrés celular ( resp a daños de DNA).

2. Se quieren identificar proteínas implicadas en la reparación del DNA en una cepa

bacteriana recién identificada, para lo cual se aíslan versiones de esta cepa que
tengan un fenotipo mutador (que acumulen mayor cantidad de mutaciones). Se aisla
una cepa mutante que tiene una frecuencia de mutaciones 10 veces mayor que la
silvestre, y al estudiarla se observa que expresa constitutivamente las polimerasas
requeridas para la síntesis translesiva del DNA. Estas células expresan las proteínas
en ausencia de inducción por un agente que dañe el DNA y las polimerasas TLS son
perfectamente normales en esta cepa.
a) ¿Por qué crees que esta bacteria tiene un fenotipo mutador? Explica tu
respuesta.

Porque están actuando en ausencia de daño y meten errores donde no debe haberlos. La
bacteria está mutada más de lo normal.

La bacteria está mutada por la expresión constitutiva de polimerasas para síntesis translesiva
del DNA; es un mecanismo de reparación en respuesta a daño de DNA ( no debería estar activo
de forma continua en ausencia de daño).Bacteria puede tener fenotipo mutador por:

-Falta de regulación en las polimerasas ( están activas incluso cuando no hay daño en
DNA).Aumenta prob de realizar replicación translesiva en sitios de ADN no dañado, pudiendo
introducir mutaciones.

-Aumento de errores de replicación: Este tipo de polimerasas tiene más tendencia a error ( que
las normales)—puede introducir mutaciones.

-Aumento de mutaciones.

b) Describe la síntesis translesiva. ¿Cómo difiere de la síntesis normal del DNA y

cuál es su función en los organismos?

Polimerasas de emergencia que replican zona dañadas. Al darse une lesión, PCNA se ubiquitina y
provoca la entrada de las pol TLS. Poco procesivas y con errores. Inducidas por el sistema SOS.

Pueden meter en los centros activos cualquier cosa pero son menos fieles. Reconoce un DNA
que la polimerasa normal no puede (ej. Un dímero de timina). A cambio, es un mecanismo
error prone porque produce daños.

Nos viene bien cuando hay daño en el DNA y la polimerasa se para y se podrían generar
roturas de doble cadena. Es mejor que sintetice la otra polimerasa aunque meta errores antes
que se rompa.
Son menos precisas y pueden meter errores, es preferible introducir una mutación a dejar una
lesión( pueden saltar o replicar a travñes de las lesiones/ tienen n sitio activo más flexible).

La función principal de la síntesis translesiva es permitir la replicación de DNA en presencia de

daños en DNA ( para que no se interrumpa la dupliación del genoma).

3. Muchos genes de E. coli están implicados en la reparación del daño producido por la
luz ultravioleta, algunos de ellos son UvrA, UvrB, UvrC y RecA. Cepas de E. coli
defectivas en alguno de estos genes son más sensibles a la luz UV comparadas con la
bacteria silvestre. Se ha observado que el doble mutante uvrA recA, es mucho más
sensible a la irradiación UV que los mutantes simples uvrA y recA, y que el doble
mutante uvrA uvrB tiene una sensibilidad parecida a los mutantes simples uvrA y
uvrB. ¿Podrías explicar por qué ocurre esto?

Una mutación en uvrA+uvrB es igual de dañino que si tenemos en una de las dos solas (en
todos los casos nos cargamos el sistema NER porque falta la proteína que reconoce el daño). Si
tenemos en uvrA+RecA, la mutación es mayor que UvrA+UvrB. Con RecA te cargas la síntesis
de recombinación homóloga o la síntesis de proteínas translesivas entre otras cosas por lo que
sumas errores en reparación, no solamente en NER.

UvrA, UvrB y UvrC son proteínas implicadas en el sistema de reparación de nucleótidos en

excisión (NER) de E. coli.

NER:es un mecanismo que repara daños en el ADN causados por la luz UV y otros agentes que
inducen daño en el ADN. Estas proteínas trabajan juntas para detectar y eliminar las lesiones
en el ADN. RecA proteína clave en la reparación del ADN y la recombinación homóloga.En este
caso (UV) RecA está involucrada en la recombinación homóloga y la activación de la respuesta
SOS en E. coli (respuesta de emergencia reparar daños DNA).

Mutantes simples y dobles:

Cuando se elimina un gen como UvrA o RecA en una cepa de E. coli, la capacidad de
reparación del ADN después de la irradiación UV se ve comprometida, lo que hace que la cepa
sea más sensible a la luz UV que la cepa silvestre. En el caso de un mutante uvrA o recA, solo se
afecta una de las vías de reparación, lo que resulta en una sensibilidad moderada a la radiación
UV.

Cuando se combinan dos mutaciones en diferentes genes, como en el mutante doble uvrA
recA, ambas vías de reparación de UV están afectadas. Esto compromete significativamente la
capacidad de la célula para reparar el daño UV, lo que resulta en una mayor sensibilidad a la
radiación UV en comparación con los mutantes simples.

El mutante doble uvrA uvrB afecta dos genes involucrados en la misma vía de reparación
(NER), pero aún conserva la capacidad de activar la vía de reparación por RecA y la respuesta
SOS. Por lo tanto, su sensibilidad es similar a la de los mutantes simples uvrA y uvrB, ya que
todavía tiene una vía de reparación funcional a través de RecA.
 4. ¿Por qué crees que muchas cepas bacterianas utilizadas en los laboratorios de
biología molecular son mutantes de RecA?

Para evitar la recombinación homologa con el plásmido. Mantienes la integridad del

fragmento de DNA extracromosómico.Menos propensos a ser infectados por
fagos( bacteriófagos (virus que infectan a bact) usan recomb homóloga).

Respuesta SOS

Los mutantes de RecA pueden ser más susceptibles a la introducción de ADN exógeno, como
plásmidos o fragmentos de ADN, a través de transformación, transducción o conjugación. Esto
facilita la manipulación genética y la introducción de material genético extranjero en la cepa
bacteriana, lo que es esencial para realizar experimentos de biología molecular como la
clonación de genes.

5. Los términos que siguen designan los pasos generales de un mecanismo de

reparación del DNA. Coloque los pasos en el orden correcto. Nombre la proteína o
proteínas que completan cada uno de los pasos en E. coli para los mecanismos de
MMR, BER y NER. Términos: ligación, síntesis de DNA, reconocimiento, escisión.

Reparación de emparejamiento incorrecto (MMR):

- Reconocimiento: Del incorrecto apareamiento de bases en el ADN recién replicado. En E.

coli, la proteína MutS es responsable de este reconocimiento.

- Escisión: Una vez que se ha reconocido el error, la proteína MutH se une y hace una
incisión en la cadena de ADN en el lado recién sintetizado del error.

-Síntesis de ADN: Las proteínas asociadas, como la ADN polimerasa III, llevan a cabo la
síntesis de ADN para reemplazar la sección dañada con la secuencia correcta.

- Ligación: ADN ligasa se utiliza para sellar los fragmentos de ADN, completando así la
reparación.

Reparación por escisión de bases (BER):

-Reconocimiento: Uns enzima de glicosilasa, como la uracilo-DNA glicosilasa (Ung),

reconoce y elimina la base dañada o incorrectamente emparejada.

-Escisión: Una endonucleasa específica hace una incisión en el sitio donde se eliminó la
base dañada. En E. coli, la endonucleasa VIII es una de las enzimas involucradas.

-Síntesis de ADN: La ADN polimerasa I o la ADN polimerasa II llenan el hueco con las bases
correctas.

- Ligación: La ADN ligasa se utiliza para sellar los fragmentos de ADN, completando así la
reparación.

Reparación por escisión de nucleótidos (NER):

- Reconocimiento: El primer paso es la detección y reconocimiento de la lesión en el ADN. En E.

coli, las proteínas UvrA y UvrB forman un complejo que realiza esta tarea.
- Escisión: Las proteínas UvrB y UvrC participan en la incisión del ADN, eliminando la sección
dañada.

- Síntesis de ADN: Después de la escisión, las proteínas UvrD y ADN polimerasa I se encargan
de rellenar el espacio con nuevas bases.

- Ligación: La ADN ligasa se utiliza para sellar los fragmentos de ADN, completando así la
reparación.

6.¿Cuáles serían las consecuencias de la pérdida función de la proteína Dam metilasa en

una bacteria? ¿Qué fenotipo se observaría?

1. Pérdida de metilación en el sitio GATC: La proteína Dam metilasa es

responsable de agregar un grupo metilo (-CH3) a la adenina en la
secuencia GATC en el ADN. La pérdida de esta actividad resultaría en la
falta de metilación en estas secuencias específicas en el genoma
bacteriano.
2. Impacto en la replicación del ADN: La metilación de las secuencias
GATC es importante para la regulación de la replicación del ADN en E.
coli. La falta de metilación en estas secuencias puede afectar la velocidad
y el control de la replicación, lo que podría dar lugar a problemas de
replicación y posiblemente a la acumulación de errores en el ADN.
3. Alteración en la regulación génica: La metilación del ADN en sitios
GATC también está involucrada en la regulación de la expresión génica
en E. coli. La falta de metilación puede alterar la actividad de los
elementos reguladores y afectar la expresión de genes específicos, lo que
podría tener un impacto en la fisiología y el comportamiento de la
bacteria.
4. Respuesta a la restricción-modificación: En algunas bacterias, como E.
coli, la metilación del ADN en secuencias GATC es parte del sistema de
restricción-modificación, que protege a la bacteria contra la infección por
bacteriófagos y la transferencia horizontal de ADN. La pérdida de
metilación podría hacer que la bacteria sea más susceptible a la infección
por fagos y a la adquisición de ADN extranjero.
5. Impacto en la estabilidad del genoma: La pérdida de la metilación en
secuencias GATC podría aumentar la inestabilidad genómica, lo que
podría dar lugar a mutaciones y recombinaciones inapropiadas.

Se observaría un fenotipo mucho más mutado  el sistema de reparación no sabría que

cadena tendría que reparar porque al no estar metilado no podría distinguir la parental de la
de nueva síntesis (se haría al azar).