PRÁCTICA 05

PROTEÍNAS III

INTRODUCCIÓN
En el laboratorio a menudo queremos medir si una proteína específica se expresa en una muestra.
O determinar si distintas proteínas sufren variaciones frente a la presencia de un determinado
agente y relacionarlo con el diagnóstico y evolución de una patología.
Para ello se cuenta con diferentes técnicas analíticas que desde hace unos años atrás ganaron su
espacio en la biología molecular y se han ido perfeccionando, entre ellas RIA, ELISA, Western
blot, Inmunofluorescencia, Inmunoprecipitación, etc.
• El western blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas.
Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola
proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante
la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de
interés.
• La Inmunofluorescencia (IF) o Técnica de Anticuerpos Fluorescentes se basa en la unión
inmunológica de un anticuerpo marcado con un fluorocromo a su antígeno homólogo. Se
considera un fluorocromo a una sustancia que, al ser excitada por una onda luminosa, es capaz
de emitir luz de menor energía (mayor longitud de onda) que la de la onda que provoca la
excitación. El fluorocromo de más amplia aplicación en esta técnica es el isotiocionato de
fluoresceína. En 1941, la IF fue introducida por Coons y colaboradores, quienes emplearon
el isocianato de fluoresceína para marcar tanto antígenos como anticuerpos. Posteriormente,
las técnicas de conjugación fueron modificadas por Riggs y colaboradores. Estos
investigadores reemplazaron el radical isocianato por el isotiocianato, este último más estable,
más fácil de conjugar y de obtener comercialmente.
• A partir de los años 50, la IF ha sido ampliamente utilizada para la identificación de parásitos,
bacterias y numerosos virus, así como para la detección de anticuerpos contra estos agentes.

Principio de la técnica
Las moléculas proteicas de los anticuerpos se unen al marcador fluorescente (fluorocromo) por
medio de firmes enlaces químicos. Como la actividad inmunológica de estos anticuerpos no se
altera, la capacidad de los mismos de unirse a los antígenos homólogos permanece íntegra.
Debido a la alta especificidad de la reacción Ag-Ac, la IF se ha convertido en un método muy útil
para el diagnóstico. Otra de sus ventajas, es el tiempo relativamente corto que se requiere para el
procesamiento de la muestra hasta llegar al resultado final. La IF es aplicable a cualquier sustancia
antigénica que se localice dentro o fuera de las células, sean antígenos protozoarios, bacterias,
virus, hormonas, enzimas, antígenos tisulares y otros.
En dependencia de los objetivos trazados, se pueden emplear distintas variantes de tinción en la
inmunofluorescencia:
Método Directo: El material se tiñe directamente con el correspondiente anticuerpo marcado.
Antígeno (Ag) + Ac fluorescente (Ac-F) Ag-Ac-F 30
Este es el método más simple y específico, aunque es menos sensible que el indirecto. Tiene la
desventaja de que para cada antígeno específico se requiere de un anticuerpo homólogo marcado
con el fluorocromo, lo cual no resulta económico ni práctico.
Método Indirecto: El anticuerpo primario (no marcado) se añade sobre la muestra y el anticuerpo
secundario (marcado) se combina con el complejo Ag-Ac primario. Si la fluorescencia es
específica, se puede identificar el antígeno cuando se conoce el anticuerpo primario o viceversa.
Ag + Ac primario Ag-Ac primario
Ag-Ac primario + Ac secundario (Ac-F) Ag-Ac primario-(Ac-F)
Este método, en comparación con el directo, presenta 3 ventajas fundamentales: es más sensible,
sirve para detectar tanto Ag como Ac y se puede trabajar una amplia variedad de Ag-Ac siempre
que se utilicen sueros de la misma especie.

EXPERIMENTO 1.
DETECTAR LA PRESENCIA DE α-TUBULINA EN CÉLULAS DE
NEUROBLASTOMA
Objetivos.
Conocer y familiarizarse con la técnica de Inmunofluorescencia.

Método
Determinación por Inmunofluorescencia indirecta de la proteína del citoesqueleto α-tubulina
en el cultivo celular de neuroblastoma

Procedimiento.
Una vez preparada la placa de cultivo celular con el número adecuado de células se les deja por
incubando por 24 horas con medio de cultivo completo a 37°C con 5% CO2 o son expuestas a
algún agente en estudio que podría afectar a la presencia y cantidad de la proteína a-tubulina.
Una vez listo el cultivo se procede a las 4 etapas fundamentales de la Inmunofluorescencia:
• Fijación
• Permeabilización
• Bloqueo
 • Inmunodetección
En el presente experimento, se usará el simulador virtual Immunology Virtual Lab l
PraxiLabs para conocer los pasos del ensayo de inmunofluorescencia a través del siguiente
video: https://www.youtube.com/watch?v=64Svwvc_rMA
Por lo que deberá anotar cada paso realizado en el simulador virtual y relacionarlos con las
etapas descritas anteriormente.
Para la detección de α-tubulina; se debe usar como anticuerpo primario un Anti α-tubulina
(producido en algún animal de experimentación puede ser mouse o rabbit) en este ensayo
fue mouse. Y el anticuerpo secundario debe ir dirigido contra la especie del anticuerpo
primario, por lo que es fundamental conocer este dato. (Si el anticuerpo primario se produjo,
por ejemplo, en ratón, el secundario deberá ser un anti-ratón obtenido en una especie
diferente a ésta) por lo que en este ensayo se usó un anti-mouse Dylight 488 (marcado con
fluoróforo verde)
En inmunofluorescencia no solo se debe marcar la proteína en interés, sino también se marca
el núcleo (con los colorantes Hoechst o DAPI) y alguna proteína constitutiva como la actina
en este caso.

Resultados: 1 Fig. Detección de F-actina usando como anticuerpo a la Faloidina

2Fig. Tinción de los núcleos con Hoechst
3Fig. Detección de a-tubulina usando como 1er anticuerpo un Anti α-tubulina mouse, y como 2do
anticuerpo un anti-mouse marcado con fluoróforo verde
4Fig. Merge o sobreposiciones de cada una de las 3 primeras imágenes para tener una visual
total del cultivo de neuroblastoma

EXPERIMENTO 2.
Lectura y discusión del artículo:
SARS coronavirus papain-like protease induces Egr-1-dependent up-regulation
of TGF-β1 via ROS/ p38 MAPK/STAT3 pathway
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4865725/pdf/srep25754.pdf

Objetivos.
Analizar y evaluar la importancia de la técnica de Inmunofluorescencia en el estudio del efecto
del coronavirus SARS en la activación de las vías MAPK.
Procedimiento
Discutir los resultados encontrados en el artículo, analizar el pool de técnicas analíticas empleadas
y la información que aportan

CUESTIONARIO
• Indique las diferentes formas de fijar células para la técnica de inmunofluorescencia
• Busque la composición del Buffer de bloqueo usado en la técnica
• Diga que es el PBS
• Para que sirve el DAPI
• ¿Qué tipo de inmunofluorescencia usaron en el artículo?
• Describa las partes del microscopio de fluorescencia e indique su uso en la técnica
• Con sus palabras explique la siguiente. figura extraída del artículo

Referencias
1. Análisis de proteínas. Electroforesis, transferencia e inmunodetección. Advansta
Corporation
2. Laboratorio de Arbovirus. TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA EL
DIAGNÓSTICO Y LA CARACTERIZACIÓN DE LOS VIRUS DEL DENGUE.
2013
3. Shih-Wein Li1, Ching-YingWang1, Yu-Jen Jou1, Tsuey-ChingYang2, Su-Hua
Huang3, LeiWan4, Ying-Ju Lin4 & Cheng-Wen Lin. SARS coronavirus papain-like
protease induces Egr-1-dependent up-regulation of TGF-β1 via ROS/ p38
MAPK/STAT3 pathway.2016