PAPER BIOQUÍMICA:

A esta desregulación metabólica (cambio metabólico de la fosforilación oxidativa a la glucólisis

aeróbica) se le denomina Efecto Warburg. El aumento de la glucólisis aerobia confiere ventajas
proliferativas a las células cancerígenas al generar gran cantidad de fuentes energéticas e
intermediarios de carbono para la biosíntesis.

Por cabios en el ADN se puede justificar que las células cancerosas no completen el proceso
completo de respiración celular.
Estas mutaciones le dan ventajas a la célula: uso de productos de la glucólisis (ácido bicarbónico y
ác láctico) que las ayudan a sobrevivir al producir elementos que favorecen supervivencia.

El ácido láctico provoca aceleración del crecimiento tumoral y promueve angiogénesis y

metástasis..
La glucólisis induce a una acidificación del mi- croambiente. La excreción de ácido láctico es la causa
de la acidificación del área tumoral. El ambiente ácido promueve la muerte de las cé- lulas normales debido a la
falta de mecanismos que se adapten a la acidez extracelular (como las mutaciones en p53 o demás proteínas de la
vía apoptótica).3,8 Lo anterior selecciona a aquellas células que resisten a un ambiente ácido en la rápida división
del tumor, impidiendo a su vez una respuesta inmunitaria contra éste, y de ésta manera facilitando los mecanismos
de selección para el crecimiento agresivo del tejido tumoral.
Algunos estudios dicen que llevare a cabo solo la glucólisis las ayuda a no ser reconocidas por el
sistema inmune, debido a que cambios en el ambiente metabólico detienen a las células del
sistema inmune.

DISCUSIÓN:
En el presente estudio, demostramos que la shikonina puede inhibir la proliferación tumoral in
vitro e in vivo a través de la disminución de la PKM2 mediada por el interruptor de la
glucólisis aeróbica en las células tumorales. Este estudio proporciona shikonina como un
candidato eficaz contra el cáncer.

En los últimos años, la acumulación de evidencias demuestra que el cambio metabólico de la

fosforilación oxidativa a la glucólisis aeróbica (efecto Warburg) es crítico para que las células
tumorales mantengan una alta proliferación y metástasis. Por lo tanto, el bloqueo de la
glucólisis aeróbica de las células tumorales, en particular el cambio de glucólisis aeróbica
mediado por PKM2, muestra un gran potencial en la terapia contra el cáncer.

-Empleando modelos celulares y de ratón, se caracterizó el efecto inhibidor de la shikonina

sobre la proliferación de células tumorales, así como el posible mecanismo que subyace a
dicho evento. Varias evidencias apoyan que la shikonina inhibe la proliferación tumoral a
través de la disminución del interruptor de la glicólisis aeróbica mediada por PKM2.

-En primer lugar, la shikonina redujo la proliferación de las células tumorales LLC(Leucemia
linfocítica crítica) y B16 y este efecto se correlacionó con su efecto inhibidor sobre la glucólisis
aeróbica de las células tumorales.

-En segundo lugar, el efecto de la shikonina en la supresión de la glucólisis aeróbica de las

células tumorales podría ser compensado mediante la modulación del nivel y la actividad de
la PKM2.
Como se muestra en la Fig. 4, el knock-down de PKM2 en células tumorales mediante PKM2
siRNA o la modulación de la actividad de PKM2 mediante pTyr, FBP o serina abolieron en gran
medida la inhibición de la glucólisis aeróbica de las células tumorales por la shikonina.

Figura 7. El tratamiento con shikonina inhibe el crecimiento del tumor implantado en ratones
SCID. (A) Imágenes tumorales representativas en ratones SCID implantados con melanoma
B16. (B) Tamaño del tumor B16 en ratones en varios días después de la inyección con varias
dosis de shikonina. (C) Peso del tumor B16 en ratones en el día 9 después del tratamiento con
varias dosis de shikonina. Los datos se presentan como media ± DE (n = 6). **P < 0.01.

MATERIALES Y MÉTODOS:

-Modelo animal. Se obtuvieron ratones machos de 6 semanas de edad con inmunodeficiencia

combinada grave (SCID) (nu/nu) del Centro de Investigación de Animales Modelo de la
Universidad de Nanjing (Nanjing, China) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de
patógenos en la Universidad de Nanjing. Los experimentos con ratones fueron aprobados por
el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nanjing, y todos
los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes.

Se inyectaron células de melanoma B16 por vía subcutánea en ratones SCID (106 células por
ratón, 6 ratones por grupo). Una vez establecidos los xenoinjertos, se administró a los ratones
portadores de tumores shikonina (0, 0,1, 1, 10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal. La
shikonina se adquirió en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.) y se disolvió en DMSO (Sigma-
Aldrich). La longitud, anchura y altura de los tumores se midieron con calibradores digitales
cada día y el volumen tumoral se calculó en consecuencia. Al noveno día, se sacrificaron los
ratones y se pesaron los tumores.

-Cultivo celular. Las células B16 y las células de cáncer gástrico MKN-45 se obtuvieron del
Instituto de Biología Celular de Shanghai, Academia China de Ciencias (Shanghai, China) y se
mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, NY) suplementado con un 10% de suero bovino fetal
(FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2 a
37 °C. Las células utilizadas para los estudios funcionales y de mecanismo en este estudio se
analizaron y autentificaron mediante el método de repetición corta en tándem (STR) por el
Instituto de Biología Celular de Shanghai.
Una de las maneras más comunes de obtener un perfil de ADN es mediante un análisis de
repeticiones cortas en tándem (STR). El procedimiento es el siguiente:

 1) Extraer y purificar el ADN de una muestra.

 2) Usar la técnica de PCR para amplificar las repeticiones cortas en tándem (STR). Un
conjunto de cebadores situados en las regiones laterales de una secuencia variable
amplificará fragmentos de diferente longitud en función del número de repeticiones
(ver la imagen a continuación).

Existe la posibilidad de que dos individuos compartan el mismo número de

repeticiones en un sitio determinado. Si usásemos solo un conjunto de cebadores (si
amplificásemos solo una región repetida), el riesgo de que dos individuos
compartiesen el mismo número de repeticiones sería demasiado alto. Por eso, al
realizar un perfil genético, se estudian al menos 13 sitios de repetición en tándem.

 3) Usar electroforesis en gel para analizar la longitud de las repeticiones en tándem y

obtener el perfil genético.

Para evaluar el efecto de la shikonina en la viabilidad y el estado metabólico de las células

B16, se añadieron diferentes concentraciones de shikonina al medio de cultivo de células B16 y
se incubaron las células durante 24 horas.

- Proliferación celular. La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo WST (sal de

tetrazolio soluble en agua) utilizando Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante31.
Las WST (sales de tetrazolio solubles en agua) son una serie de otros colorantes solubles en agua para
ensayos MTT, desarrollados para dar diferentes espectros de absorción de los formazanos formados.
La reducción de MTT y otros colorantes de tetrazolio depende de la actividad metabólica celular
debido al flujo de NAD (P) H. Las células con un metabolismo bajo, como los timocitos y los
esplenocitos, reducen muy poco el MTT. En contraste, las células que se dividen rápidamente exhiben
altas tasas de reducción de MTT. 

Brevemente, las células LLC y B16 se sembraron en placas de 96 pocillos (Corning) a una
densidad de 104 células por pocillo en DMEM y se incubaron durante 24 h (37 °C y 5% CO2). A
continuación, se sustituyó el medio por DMEM libre de suero o DMEM libre de suero con
distintas concentraciones (0, 0,01, 0,1, 1 o 10 μM) de shikonina (el volumen total de cada
pocillo fue de 200 μl). Tras incubar durante otras 24 h, se determinó el número de células
viables midiendo la absorbancia (OD450 nm).

-Ensayo de apoptosis. La apoptosis de las células se detectó mediante un ensayo de tinción

con Annexin V-FITC/yoduro de propidio (PI). El análisis citométrico de flujo de las células
apoptóticas se llevó a cabo utilizando un kit de tinción Annexin V-FITC/PI (Invitrogen). Después
de lavarlas con PBS(TAMPÓN FOSFATO SALINO) frío, las células se volvieron a suspender en
tampón de unión (100 mM HEPES, 100 mM NaCl y 25 mM CaCl2, pH 7,4) y se tiñeron con
Annexin V-FITC/PI a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 15 minutos. A
continuación se evaluaron las células apoptóticas separando las células positivas para PI y
Annexin V en un FACSCalibur (citómetro de flujo analógico de sobremesa con 1 láser azul y un
diodo rojo) (BD Biosciences).

Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Figura 6. El tratamiento con shikonina aumenta la apoptosis de las células tumorales de forma
dependiente de la dosis y del tiempo. (A) Panel izquierdo: imagen representativa de citometría
de flujo de la apoptosis de células B16 marcadas con FITC-Anexina V/PI. Panel derecho:
resultados del análisis de las imágenes de citometría de flujo. (B) Panel izquierdo: imagen de
citometría de flujo representativa de la apoptosis de células de cáncer gástrico marcadas con
FITC-Anexina V/PI. Panel derecho: resultados del análisis de las imágenes de citometría de
flujo. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos individuales por
triplicado. *P < 0.05. **P < 0.01. ***P < 0.001.

-Western blot. Las proteínas celulares se extrajeron como se ha descrito previamente. Para el
western blot se utilizaron anticuerpos contra PKM2, p-PKM2 adquiridos a Abcam (Shanghai,
China). GAPDH (Cell Signaling Technology, CA) sirvió como control interno. Gliceraldehído 3-
fosfato deshidrogenasa

Western blot es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína

específica en una muestra de sangre o tejido

-Por último, el análisis western blot mostró directamente que el tratamiento con shikonina
disminuyó la fosforilación de PKM2 en las células B16, aunque no afectó al nivel celular total
de PKM2.

-Medición de la producción de lactato, la absorción de glucosa y la producción de ATP. El

nivel de lactato en el medio de cultivo celular se midió con el kit de ensayo de lactato (#K607-
100, BioVision, Milpitas, CA, EE.UU.) según el método descrito anteriormente32. La glucosa en
los lisados celulares se midió con el kit de ensayo de glucosa (BioVision, #K606-100). Para
detectar la captación de glucosa y la producción de lactato, se recogieron los sobrenadantes de
cultivo de células tumorales con diferentes tratamientos y se utilizó el medio de cultivo fresco
como control. Se añadieron cantidades iguales (2-10 μl) de muestras a una placa de 96 pocillos
y el volumen de cada pocillo se ajustó a 50 μl con tampón de ensayo de glucosa o lactato.
Mientras tanto, se preparó una curva estándar con el mismo protocolo. Tras 30 minutos de
reacción a 37 °C en la oscuridad, se midió la absorbancia (OD570 nm) o la intensidad de
fluorescencia (Ex/Em = 535/590 nm). La absorción de glucosa se determinó restando el nivel
de glucosa en las muestras analizadas del nivel inicial de glucosa en el medio fresco. La
producción de lactato se determinó mediante una curva estándar. Teniendo en cuenta que el
número de células de cada muestra puede ser diferente, todos los niveles de glucosa o
producción de lactato se normalizaron finalmente al nivel de proteínas. Los niveles de ATP se
midieron utilizando un kit de ensayo de ATP (Celltiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay,
Promega).

-Análisis estadístico. Cada experimento era representativo de al menos tres experimentos

independientes. Los datos se presentan como la media ± DE de al menos tres experimentos
independientes. Las diferencias entre grupos se analizaron mediante la prueba t de Student y
las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P < 0,05.
CONCLUSIONES:

Aunque nuestros resultados demuestran que la shikonina suprime la glucólisis aeróbica de las
células tumorales a través de la inhibición de la fosforilación de PKM2, la base molecular de la
reducción de la fosforilación de PKM2 por la shikonina sigue siendo desconocida en esta etapa.

Mediante el estudio de la actividad de la PKM2 después de tratarla con diferentes moléculas

pequeñas, estudios anteriores han demostrado que el activador II de la PKM2 (DASA), así como
los intermediarios glucolíticos FBP y serina, pueden modular la actividad de la PKM2 a través
de la detención de la PKM2 en forma estructural de tetrámeros.
Es posible que la shikonina afecte a la actividad de la PKM2 de forma similar.

Además, como se ha informado que la proteína quinasa Akt2 es capaz de promover la

fosforilación de PKM2 en células tumorales, la shikonina puede inhibir la fosforilación de PKM2
a través de la supresión de la expresión y actividad de dicha proteína quinasa.

Dado que la fosforilación de PKM2 puede cambiar la conformación de PKM2 de tetrámero a

dímero, la inhibición de la fosforilación de PKM2 por shikonina puede tener un papel similar en
la prevención del cambio de conformación de PKM2 de tetrámero a dímero.

PKM2 es crítico en la mediación de la glucólisis aeróbica. Si se expresa, puede ser de

dos tipos, uno que facilita el movimiento de glucosa hacia las mitocondrias y el otro tipo
que facilita el movimiento de glucosa hacia la conversión en lactato.
Si, por otro lado, se inhibe la PKM2, hay una acumulación de intermedios glucolíticos
que finalmente se mueven hacia la fase anabólica para la producción de aminoácidos,
nucleótidos y lípidos.