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Curso acadmico: 2012/13

Asignatura: ANLISIS QUMICO Grado: Ciencia y Tecnologa de los Alimentos

Curso acadmico: 2012/13

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CONTENIDOS
1. Introduccin
Fluorescencia, Fosforescencia, Quimioluminiscencia Caractersticas analticas

1. 2. 3.

Teora de la Fluorescencia y Fosforescencia Tipo de espectros Variables que afectan a la Fluorescencia


Fluorescencia y estructura Fluorescencia y entorno qumico Fluorescencia y concentracin

1. 2.

Instrumentacin Aplicaciones al anlisis de alimentos

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1. Introduccin

Mtodos luminiscentes moleculares


Basados en la emisin de radiacin electromagntica por molculas que previamente han sido excitadas. Cada especie A emite radiaciones de caractersticas Anlisis cualitativo La intensidad de la radiacin IF es proporcional a la [A] Anlisis Espectr Anlisis cuantitativo cualitativo

A + h

A*

o de emisi n

Anlisis Cuantitativo

Absorcin de fotones (h )

Reaccin qumica

Fluorescen cia

Fosforescenci a

Quimioluminiscen cia

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1. Introduccin

La fluorescencia es un fenmeno que fue conocido en Excitaci Emisin el siglo XIX por Stoke: observ n Luz Luz fluorescencia en el mineral de mayor UV Fig. 1 fluorita . El agua tnica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina. La quinina es un alcaloide de sabor amargo que se extrae de la corteza del rbol de la quina, y tiene propiedades antipirticas, analgsicas y contra la malaria. La quinina es una sustancia fluorescente Agua tnica

Bajo luz del sol

Fig. 2

Bajo luz ultravioleta

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1. Introduccin

Caractersticas analticas Sensibilidad (ppb) Gran intervalo lineal Caractersticas Selectividad Menor aplicabilidad que los mtodos de absorcin Mayor interferencia ambiental
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2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescencia

A + hexcitacin hemisin

A*

A+

E1 hexcitaci E0
n

hexcitacin hemisin excitacin emisin

hemisi
n

Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia.


Estado electrnico molecular singlete: los espines de los eestn apareados
Estado singlete fundamen tal Estado singlete excitado Estado triplete excitado

Estado electrnico molecular triplete: los espines de los eestn desapareados


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Fluorescen cia

Fosforescenci a

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2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescencia

Diagrama parcial de energa para un sistema Estados fotoluminiscente Estados singletes


S2

excitados Relajaci Conversi n n vibracion interna al

tripletes excitados

Cruce entre sistemas S1 T1

Energi a

Absorci n excitac in
S0

Fluoresce ncia

Conversi n interna

Fosforescenc ia

Estado fundamental

Relajaci n vibracion al

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2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescencia

Velocidad de absorcin y de emisin La velocidad a la que un fotn de radiacin es


absorbido es grande: el proceso requiere del orden de 10-14 a 10-15 s La emisin fluorescente, tiene lugar a una velocidad relativamente ms lenta, entre 10-9 a 10-5 s, y depende inversamente de la absortividad molar del pico de absorcin correspondiente al proceso de excitacin La emisin fosforescente requiere tiempos del orden de 10-4 a 10 s ms.

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2. Teora de la fluorescencia y de la fosforescencia

El camino el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado Estado excitado RELAJACIN VIBRACIONAL: no radiante CONVERSIN INTERNA: no radiante CONVERSIN EXTERNA: no radiante CRUZAMIENTO radiante FLUORESCENCIA: emisin de un fotn de radiacin ENTRE SISTEMAS: no FOSFORESCENCIA: emisin de un fotn de radiacin

Procesos de msdesactivacin probable hacia

Estado fundamental La fotoluminiscencia slo la presentan un nmero relativamente pequeo de sistemas con caractersticas estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de

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3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia

Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia y fosforescencia Fenantreno Espectro de excitacin: Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia, manteniendo fija la emisin y variando la excitacin Espectro de emisin : Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia manteniendo fija la excitacin y variando la emisin. Los anlisis se efectan

Excitaci n

Emisin Fluorescen te

Emisin Fosforesce 10 nte

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3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia

Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia

Cada uno es una imagen especular del otro. Las emisin son mayores que excitacin
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3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia

Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia

Antraceno a) espectro excitacin b) espectro fluorescente


Cada uno es una imagen especular del otro

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4. Variables que afectan a la fluorescencia

Estructura qumica

Entorno qumico

Sustancia fluorescente

Intensidad de emisin fluorescente

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4. Variables que afectan a la fluorescencia

= n molculas que emiten fluorescencia/n total de molculas excitadas = n fotones emitidos/n fotones absorbidos

Rendimiento cuntico de fluorescencia:

= KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd

K = las constantes de velocidad de los diversos procesos de desactivacin posibles: fluorescencia (KF), cruce entre sistemas (Kces), conversin externa (Kce), conversin interna (Kci), predisociacin (Kpd) y disociacin (Kd ).

Rendimiento cuntico y tipo bajos de Las variables que conducen a valores altos de K y valores F KF, Kpd, Kd Estructura qumica transicin: del resto de velocidades exaltan la fluorescencia La eficacia cuntica es mayor para las Kces, Kce, Kci Entorno qumico transiciones -*
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4. Variables que afectan a la fluorescencia

Pueden presentar fluorescencia: Compuestos con estructuras con dobles enlaces altamente conjugados. Compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifticas La fluorescencia ms intensa es la que presentan los Fenantreno compuestos que contienen grupos funcionales aromticos Latransiciones mayora de con los * de baja energa Antraceno hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en disolucin. Fig. 1 Fig. 2 La eficacia cuntica normalmente aumenta con el 15 nmero de anillos y con su

Fluorescencia y estructura

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4. Variables que afectan a la fluorescencia

Fluorescencia y estructura
Heterociclos sencillos no fluorescentes Fusionados con anillos bencnicos s presentan fluroescencia
N O
Furano

S
Tiofeno

H N
Pirrol

Piridina

H N

Quinoleina

Isoquinoleina

Indol

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4. Variables que afectan a la fluorescencia

Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes La sustitucin en el anillo bencnico produce:

Desplazamientos de la de los mximos de excitacin y emisin Un aumento o disminucin de la intensidad de fluorescencia segn el sustituyente Efecto de la sustitucin en la fluorescencia del benceno
Compuesto Benceno Tolueno Propilbenceno Fluorobenceno Clorobenceno Bromobenceno Iodobenceno Fenol In fenolato Anisol Anilina In anilinio cido benzico Benzonitrilo Nitrobenceno Frmula C6H6 C6H5CH3 C6H5C3H7 C6H5F C6H5Cl C6H5Br C6H5I C6H5OH C6H5O C6H5OCH3 C6H5NH2 + C6H5NH3 C6H5COOH C6H5CN C6H5NO2 Longitud de onda de la fluorescencia, nm 270-310 270-320 270-320 270-320 275-345 290-380 285-365 310-400 285-345 310-405 310-390 280-360 Intensidad relativa de la fluorescencia 10 17 17 10 7 5 0 18 10 20 20 0 3 20 0
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4. Variables que afectan a la fluorescencia

s electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y OR, aumentan la eficacia de la fluorescencia desplazndola a mayores .

Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes

s electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y NO 2, reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transicin n- Los halgenos producen efecto de tomo pesado interno

Los grupos sulfnicos no modifican significativamente la fluorescencia

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4. Variables que afectan a la fluorescencia

Fluorescencia y estructura. Efecto de la rigidez estructural

Fluoreno

C HH

Bifenilo

= = 0,2 1 La fluorescencia aumenta con la rigidez molecular. La emisin fluorescente aumenta cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una superficie slida ya que aumenta su rigidez: Indicadores de adsorcin

La influencia de la rigidez tambin explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgnicos cuando forman complejos con iones metlicos. Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de la 8hidroxiquinolena es mucho menor que la de su complejo de zinc 19

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4. Variables que afectan a la fluorescencia

Fluorescencia y entorno qumico Disolvente


La fluorescencia de una molcula disminuye en presencia de disolventes que contengan tomos pesados: tetrabromuro de carbono, yoduro de etilo

Temperatura
Un aumento de temperatura provoca disminucin de I F

IF

Temperatura C

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4. Variables que afectan a la fluorescencia

pH

Fluorescencia y entorno qumico


H H N: H+ H N H H + N

HHH N+

Influye en la fluorescencia de compuestos aromticos con sustituyentes cidos o bsicos en el anillo.

Anilina If = 20

In anilinio IF = 0

Oxgeno disuelto
Reduce la intensidad de fluorescencia de una disolucin

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4. Variables que afectan a la fluorescencia

es La intensidad de emisin fluorescente (IF) proporcional a la potencia radiante de la luz incidente (P0) y a la concentracin de la especie fluorescente (c), si la absorbancia de la disolucin es pequea a las longitudes de onda de excitacin y de emisin .
Anlisis cuantitativo

Fluorescencia y concentracin

IF = k P0 c Relacin entre la intensidad de fluorescencia y la IF = K c


concentracin Anlisis de trazas

Al aumentar P0 aumenta IF

Para concentraciones de analito altas, IF deja de ser proporcional a c


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5. Instrumentacin

Fuente de radiacin

Esquema de un espectrofluormetro
Monocromador de excitacin exc
Una longitud de onda

Cubeta de muestra
Luminiscencia a muchas longitudes de onda

Muchas longitudes de onda

en ngulo recto

Monocromador de emisin
Una longitud de onda

em

Detector

Registrador o PC
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5. Instrumentacin

Fuente de luz

De mayor potencia que las que se utilizan en absorcin. La energa radiante emitida en fluorescencia es directamente proporcional a la intensidad de la fuente.

Seleccin ex y em

Lmpara de arco de mercurio, Lmpara de arco de xenn, Lseres de N2 o de Ar Filtros: fluormetro Monocromadores : espectrofluormetro

Cubeta s Detectores

Vidrio o cuarzo Rectangulares, con las cuatro caras pulimentadas Tubos fotomultiplicadores.
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6. Aplicaciones

Anlisis cualitativo
Poca aplicacin. la fluorescencia es valiosa en la identificacin de derrames de petroleros.

Anlisis cuantitativo La aplicacin ms importante de la fluorimetra corresponde al


anlisis de productos alimenticios, sustancias farmacuticas, muestras clnicas y productos naturales Los mtodos fluorescentes son : Aplicables a intervalos de concentracin ms bajos los de absorcin Tienen sensibilidades mayores que los mtodos de absorcin. Tienen una precisin y exactitud menor que las de los de absorcin. 25 Muy selectivos, con una selectividad mayor que los mtodos

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6. Aplicaciones

Anlisis cuantitativo
Se han desarrollado mtodos cuantitativos basados en fluorescencia para especies inorgnicas, orgnicas y bioqumicas.

Determinacin de especies inorgnicas

Los basados en la reaccin del analito con un agente de complejacin para formar un complejo fluorescente.

Se utilizan para cationes


Determinacin de Al (III) El granate de alizarina R permite detectar Al3+ a niveles de 0,007 g/mL. GAR + Al (III) GAR - Al (III)

Los indirectos, basados en la disminucin de la fluorescencia, quenching, como resultado de la interaccin del analito con un reactivo fluorescente. Se utilizan para aniones y determinacin de oxgeno en disolucin. Determinacin de anin F-, se basa en la desactivacin de la fluorescencia del complejo GAR - Al (III) GAR - Al (III) + FGAR + 26 Al(III)-F

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6. Aplicaciones

Anlisis cuantitativo Determinacin de sustancias orgnicas y El nmero de aplicaciones de los mtodos fluorimtricos a bioqumicas

problemas orgnicos es muy elevado Pueden determinarse por fluorescencia los aminocidos, protenas, coenzimas, vitaminas, cidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides, la adenina, cido antranlico, hidrocarburos policclicos aromticos, cistena, guanina, isoniazida, naftoles, cido saliclico, Tambin muchos agentes medicinales pueden determinarse por triptfano, cido rico y numerosos metabolitos. fluorimetra, como la adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procana, reserpina y dietilamida del cido lisrgico (LSD). La aplicacin ms importante de la fluorimetra corresponde al anlisis de productos alimenticios, sustancias farmacuticas, muestras clnicas y productos naturales.
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6. Aplicaciones

Aplicaciones al anlisis de alimentos Determinacin de cationes y aniones Determinacin de quinina Determinacin de colorantes Determinacin de pesticidas Determinacin de vitaminas

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