Nota de aplicación

Purificación del ARN total de células

mononucleares de sangre periférica
Steffen Zingler y Peter Porschewski

La sangre periférica se utiliza a menudo para estudios in vitro del sistema inmunitario humano o de las respuestas inmunitarias,
como la inflamación. Una parte importante del sistema inmunológico humano está representada por las células
mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC son células sanguíneas caracterizadas por un núcleo redondo y
consisten principalmente en linfocitos (células T, células B y células NK), macrófagos y células dendríticas. Aquí,
describimos el análisis de la respuesta transcripcional inducida por lipopolisacáridos de PBMC aislada de sangre total
utilizando el RNeasy Mini Kit o RNeasy® Micro Kit, RT 2 First Strand Kit, RT 2 SYBR® Green ROX™ qPCR Mastermix y RT 2

Profiler PCR Arrays.

Introducción
PBMC se utilizan ampliamente en inmunología o investigación del cáncer. De especial interés, es
el análisis de la expresión de citoquinas como una respuesta de activación del sistema inmune por
microorganismos (virus o bacterias) o estimulación inmune debido a la vacuna o tratamiento
farmacológico. (1) En la infección bacteriana, la respuesta inmune es provocada por
lipopolisacáridos (LPS) y causa una respuesta dinámica en la expresión génica de PBMC. La
inducción in vitro de la respuesta inmune utilizando LPS es un buen sistema de control para
analizar los genes involucrados en la respuesta transcripcional inducida por LPS.

PBMC se puede aislar de sangre total utilizando medios de gradiente de densidad como Ficoll-
Paque®, un polisacárido hidrófilo. Debido a sus propiedades físicas, se puede utilizar para separar
la sangre entera a través de la centrifugación de gradiente de densidad. Después de la
centrifugación, la sangre se separa en una capa superior de plasma, una capa media y blanca de
PBMC y una fracción inferior de células polimorfonucleares (por ejemplo, neutrófilos y eosinófilos)
y eritrocitos, que se eliminan durante la centrifugación debido a su mayor densidad.

Materiales y métodos
La sangre se extrajo en tubos de litio-heparina de voluntarios sanos con consentimiento informado por
escrito. Para la estimulación de la sangre con LPS, se preparó una solución madre de 0,1 mg/ml
en dimetilsulfóxido (DMSO) y se dispensaron 6 μl de la solución madre en un pocillo de una
placa de 6 pocillos. La solución madre de LPS se diluyó agregando un medio completo RPMI de
500 μl para prevenir la hemólisis por parte del DMSO. Inmediatamente después de la dilución del
reactivo estimulante, se agregaron 5,5 ml de sangre estabilizada con Li-heparina a cada pocillo y se
incubaron durante 1 h a 100 rpm en una incubadora (37 ° C; 90% de humedad relativa; 5%
CO2). Las PBMC se aislaron utilizando el protocolo de suplemento QIAGEN "Aislamiento de células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) y purificación de ARN total de PBMC utilizando el kit
RNeasy Micro o Mini". En este protocolo, las PBMC se aíslan de sangre total por centrifugación
por densidad utilizando Ficoll-Paque como medio de gradiente de densidad. El ARN de PBMC
aislado fue

muestras ensayos
CT extraído utilizando el RNeasy Mini o RNeasy Micro Kit. El TRT tampón
9
se complementó con -mercaptoetanol. El rendimiento y la calidad del
8
medio ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop® 8000
7
6 y un bioanalizador Agilent® 2100. Los ADNc de las muestras de control
5 y estimuladas se prepararon utilizando 250 ng del ARN purificado y el
4 kit RT2 First Strand. En el siguiente paso, el ADNc wse mezcla con RT
3
2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix y la mezcla se apliquota en los
2
pocillos de una matriz de PCR de QC de ARN RT 2 o una matriz de PCR
1
0 de perfil RT2 Matriz de PCR Inflamatorio humano Citoquinas y
RNeasy Mini RNeasy Micro
receptores. Después de la PCR, la expresión relativa se determinó
Figura 1. ARN total obtenido de 1 x 10 y 1 x 10 7 6 utilizando los datos del ciclador en tiempo real y el método CT. Las
PBMC utilizando el protocolo RNeasy Mini o diferencias en la expresión génica entre las muestras de control y
RNeasy Micro. Los rendimientos promedio estimuladas se expresaron como cambios de pliegue y se visualizaron
determinados por un espectrofotómetro NanoDrop 8000
utilizando gráficos de volcano o dispersión.
fueron de 6,29 μg de ARN y 0,29 μg de ARN.

Resultados: Calidad del ARN

El ARN total se extrajo de PBMC utilizando el RNeasy Mini y Micro Kit
por duplicado (para cada kit). El rendimiento se determinó mediante el
uso de un espectrofotómetro NanoDrop 8000 (Figura 1). Los
rendimientos promedio de ARN obtenidos de 1 x 10 7 y 1 x 10 6 PBMC
fueron de 6,29 μg y 0,29 μg de ARN con los protocolos RNeasy Mini y
RNeasy Micro, respectivamente.

Para controlar la integridad y la calidad general de los eluidos de ARN,

las muestras se verificaron utilizando un bioanalizador Agilent 2100 y
por PCR en tiempo real utilizando la matriz RT2 RNA QC PCR. Todas las
muestras se analizaron utilizando un Agilent RNA 6000 Nano Kit y 1 μl
de cada ARN eluate. Los resultados se muestran en la Figura 2.

U
1 minuto FU
n
250
FU 200
350 150
300
250 100
200 50
150
0
100
50 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (s)
0 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (s)

todos los eluidos muestran picos agudos (izquierda) y 9.5 (derecha).

para el ARN ribosómico 18S y 28S. ■L os eluidos de ARN B obtenidos de la
extracción de ARN a partir de 1 x 10 6
No hay hombros visibles, especialmente
Figura 2. Análisis de eluidos de ARN en un a la izquierda de cada pico, PBMC dieron valores de RIN de 9,6
bioanalizador Agilent 2100. Cada eluyido (1 μl) se indicando ARN de alta calidad. U■n ARN se (izquierda) y 10 (derecha).
aplicó a un chip RNA nano. Los electroferogramas de elueve de 1 x 10 7
PBMC resultó en valores RIN de 9.5

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B
FU 5 Mic
30
25 Micrófono FU6
20 50
15 40
10 30
5
20
0
10

20 25 30 35 40 45 50 55 60 (s)
0

20 25 30 35 40 45 50 55 60 (s)

Muestra & Ensayo

Tecnologías
Ágil Bioanalizador análisis Mostró Alta calidad ARN en todo eluida. Extracción de ARN de PBMC
CT
Electroferogramas y gel Imágenes mostrar afilado Picos para 18S y 28S
45
ribosomal ARN. El ARN integridad número (RIN) valores para todo Muestras
40

fueron consistentemente ≥9.5. Valores RIN consistentes en múltiples

muestras 35

Dentro de cada experimento son deseables para comparaciones de datos de

calidad confiables. 30
25
La calidad de los eluidos de ARN se evaluó utilizando la matriz de PCR RT2 RNA
20 QC. El RT2 RNA QC PCR Array contiene controles para la integridad del ARN
15,la presencia de inhibidores de la transcripción inversa y PCR 10 ACTB HPRT1 RTC PPC1 GDC NRT PPC2 NTC

amplificación y la presencia de contaminación genómica u otra contaminación

5
del ADN.
0
Los resultados se muestran en las Tablas 1 y 2 y en la Figura 3.

Genes y control en RT 2 RNA QC PCR Array

Figura 3. Análisis de ARN utilizando la matriz RT2 RNA

Representación gráfica de los
QC PCR.
Mesa 1. valores obtenidos para los valores medios de C para los eluidos de ARN
T
Significar CT eluidos de ARN extraídos con el Mini Kit RNeasy
(1 x 107 PBMC) o el RNeasy Micro Kit (1 x 106 PBMC).
RNeasy Mini Botiquín RNeasy Micro Botiquín Los valores medios de CT derivados de ambas
Genes/controles Medio CT SD Medio CT SD muestras son comparables sin diferencias significativas.
Los genes de mantenimiento ACTB y HPRT1 no varían
ACTB 17.08 0.02 17.95 0.01 significativamente entre las muestras. No hay indicios
HPRT1 25.25 0.11 25.60 0.06 de inhibición de la transcripción inversa o PCR o
contaminación con ADN genómico. Los valores de corte
RTC 20.67 0.06 21.37 0.19 para PPC1, GDC, NRT y NTC se muestran mediante las
líneas rojas.
PPC1 21.15 0.13 20.56 0.05

GDC 41.00 0.00 41.00 0.00

TRN 41.00 0.00 39.50 1.50

PPC2 19.01 0.10 18.93 0.03

NTC 37.68 3.32 41.00 0.00

-actina (ACTB) y HPRT (HPRT) son dos genes de mantenimiento que se expresan en un
nivel superior y un nivel medio-bajo. Los niveles de expresión de ambos genes permiten
predecir el valor umbral esperado del ciclo en análisis futuros. El control de transcripción
inversa (RTC) prueba la eficiencia del paso de transcripción inversa durante la síntesis de ADNc.
El control de PCR positivo (PPC) es una plantilla de plásmido con una secuencia artificial y
cebadores para detectarlo. Se caracterizan dos controles con (PPC1) o sin plantilla
experimental (PPC2) para probar la presencia de inhibidores de PCR en las muestras de
ARN. El control genómico del ADN (GDC) detecta específicamente la contaminación del
ADN genómico en el eluido de la muestra. Las pruebas sin control de transcripción
inversa (NRT) parala contaminación genómica del ADN en la muestra de ARN
al tratar de amplificar un gen de mantenimiento directamente de la muestra de
ARN. Las pruebas de control sin plantilla (NTC) para la contaminación general del ADN en el
sistema de PCR introducido durante la configuración de la placa.

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Mesa 2. Verificación de CT valores contra Corte valores para el diferente
mandos y validez criterios

RNeasy
Ensayo

RTC Calcular C =
PPC2 TT – C PPC2 = <5
C RTC

CT = 20 ±2

GDC CT >35 41 ✓ 41 ✓
TRN CT >35 41 ✓ 39.5 ✓
NTC CT >35 37.68 ✓ 41 ✓

Muestra & Ensayo

Tecnologías
Los valores medios de CT derivados de ambas muestras (ARN eluido de RNeasy Mini [1 x 10 7

PBMC] y RNeasy Micro [1 x 106 PBMC]) no muestran diferencias significativas. Los genes de
mantenimiento ACTB y HPRT1 no varían significativamente entre las muestras con el CT para
ambos genes
≤1 (Cuadro 1; Figura 3). No inhibición de la transcripción inversa o PCR o contaminación con
se observó ADN genómico . Todos los valores de C T se verificaron con los valores de corte de los
diferentes controles para verificar los criterios de validez; con todos los valores de CT válidos.
Los resultados demuestran que el ARN de alta calidad se puede extraer de PBMC aislado utilizando
el protocolo de extracción RNeasy Mini o Micro RNA .

Resultados: Estimulación inmune de PBMC

Analizamos larespuesta de PBMC después de la inducción con un reactivo inmunoestimulante. La
sangre entera se incubó con LPS y se utilizó un control simulado. Las PBMC se aislaron utilizando
el método de gradiente de densidad descrito , después de exponer las células sanguíneas al
reactivo. El ARN se extrajo de PBMC inducida y control (1 x 107 PBMC cada una) como se describió
anteriormente. El ADNc se transcribió utilizando 250 ng de cada ARN extraído en la reacción de
transcripción inversa. Las diferencias en la expresión génica entre la muestra inducida y la
muestra de control se analizaron utilizando el RT2 Profiler PCR Array Human Inflammatory
Cytokines & Receptors. Esta matriz perfila la expresión de un panel enfocado con 84 genes que
codifican citoquinas inducibles, quimiocinas y sus receptores para genes relacionados con el sistema
inmune.

Se utilizaron tres matrices para cada muestra y los valores de CT obtenidos de PCR en tiempo real se
cargaron en una herramienta de análisis basada en la web para su posterior análisis. Las
diferencias en la expresión génica entre las muestras de control y estimuladas se basaron en los
valores promedio de C T, calculados por el método C T, y expresados como cambios de
pliegue. Todos los controles integrados (RTC, PPC y GDC) en el rray pasaron los criterios de
validez. Los niveles de expresión génica se normalizaron contra los genes de mantenimiento
GAPDH (gliceraldehído-3-fospahte deshidrogenasa) y RPLP0 (proteína ribosómica grande P0).

La Tabla 3 muestra todos los genes con 2 veces o más cambios en la expresión génica. En total,
17 genes fueron regulados al alza en la muestra inducida por LPS (Grupo 1 ), mientras que 1 gen
fue regulado a la baja.
Tabla 3. Inducción de genes de quimiocinas y citoquinas después de la estimulación con LPS

Genes

Grupo 1 (inducido por

LPS) vs. grupo control Símbolo Regulación Valor p
genético de
plegado
BMP2 3.8 0.0063

CCL20 46.9 0.0241

CCR8 2.7 0.0207

CXCL1 6.8 0.0228

CXCL2 7.9 0.0195

CXCL3 20.8 0.0201

CXCL5 2.3 0.0278

CXCL6 6.7 0.0318

Regulado al alza CXCL9 2.2 0.0242

CXCR2 3.2 0.0498

IL1A 66.7 0.0160

IL1B 22.7 0.0117

IL1RN 19.3 0.0163

IL27 5.8 0.0014

IL7 9.3 0.0085

IL8 3.9 0.0359

NAMPT 2.3 0.0414

Regulado a la baja VEGFA –2.3 0.0133

Todos los genes se enumeran con una diferencia en la expresión génica (regulada hacia
arriba o hacia abajo) después de la estimulación con LPS y un cambio de 2 veces o más en la expresión génica.
Una diferencia en la expresión génica a p ≤0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Además, las diferencias en la expresión génica obtenida para los 84 genes se visualizaron
utilizando un volcán o un diagrama de dispersión para dar una visión general de los 84 genes
en la matriz (Figura 4).

Muestra & Ensayo

Tecnologías
 A Grupo 1 vs. Control Grupo B Grupo 1 vs. Grupo de control

– Registro 10 (valor
Registro10 (Grupo 1
C T)

P)
Registro 10 (Grupo de control 2 CT )
Registro 2 (cambio de pliegue del Grupo
1/Grupo de control)

Figura 4. Efecto de la estimulación de LPS en PBMC de sangre total. ■A Las diferencias en la expresión génica
después de la estimulación con LPS se visualizan en un diagrama de dispersión. Los genes regulados al alza
se indican mediante un círculo rojo y los genes regulados a la baja con un círculo verde. Las líneas diagonales
indican el límite del cambio de 2 veces en la expresión génica. ■ B En el gráfico del volcán, los cambios de pliegue
se visualizan en relación con el valor p. Todos los círculos por encima de la línea azul indican genes con un cambio de 2
veces o más
en la expresión génica y un valor p ≤0,05. Los genes regulados al alza se indican mediante un círculo
rojo y los genes regulados a la baja con un círculo verde. La significación para la regulación del pliegue obtenida fue
aceptada en p ≤0,05. Grupo 1: muestra estimulada por LPS; Grupo control: muestra sin estimulación LPS.

La regulación positiva de IL1B e IL8 en PBMC tratada con LPS se describe en la literatura (2). Sin
embargo, la estimulación con LPS induce la coexpresión de ciertas citoquinas y quimiocinas, así
como sus receptores. También se informan interacciones físicas, como las interacciones proteína-
proteína. Para 10 de los genes significativamente regulados, las reacciones después de
laestimulación LPS se visualizan en una red (Figura 5). Siete genes subyacen a una coexpresión,
mientras que 9 genes muestran interacciones físicas. La red fue creada utilizando Gene Network
Central Pro. GNCPro™ integra el conocimiento biológico (por ejemplo, a partir de datos disponibles
públicamente) y muestra gráficamente las interacciones entre un grupo de genes.

IL1B CXCL1 CXCL3

CXCL2

CXCL9
NAMBT
IL8

IL1RN

CCL20
CXCL5
CXCR2

CXCL6

BMP2

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Figura 5. Relación de genes regulados después de la estimulación LPS de sangre total y aislamiento de
PBMC. Las relaciones entre los genes que se regularon después de la estimulación de LPS se representan gráficamente
utilizando GNCPro. La coexpresión de genes se indica mediante líneas púrpuras y las interacciones físicas se
indican mediante líneas amarillas.

Muestra & Ensayo

Tecnologías
Conclusiones
■■ Este estudio reveló que las PBMC aisladas son muy adecuadas para experimentos in vitro para
estudiar una respuesta inmune dinámica y sistemática después del tratamiento de sangre total
con LPS. El ARN de alta calidad se puede extraer de PBMC aislada.
■■ El cambio transcripcional inducido por LPS en la expresión génica se puede perfilar con un
enfoque basado en PCR en tiempo real; utilizando una colección de 84 genes que están
involucrados en la regulación de la inflamación y la respuesta inmune después de la infección
bacteriana.
■■ Las PBMC representan un buen sistema modelo para la respuesta a las células infectadas por
virus y bacterias, así como para transformar las células tumorales o para probar la eficacia de
nuevos fármacos.

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PAHS-011Z
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* Otros tamaños de kit están disponibles; Por favor pregunte.

Referencias

1. Kierstead, L.S., Dubey, S., Meyer, B., et al. (2007) Tasas mejoradas y magnitud de las respuestas inmunes detectadas
contra una vacuna contra el VIH: efecto del uso de un proceso optimizado para aislar PBMC. SIDA Res. Zumbido.
Retrovirus. 23 y 86.

2. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. (2013) Los monocitos, las células mononucleares
de sangre periférica y las células THP-1 exhiben diferentes patrones de expresión de citoquinas después de la
estimulación con lipopolisacáridos. Mediadores inflamm. 2013, 697972.

Para obtener información actualizada sobre licencias y exenciones de responsabilidad específicas del producto, consulte el
manual del kit QIAGEN o el manual del usuario correspondiente. Los manuales del kit QIAGEN y los manuales de usuario
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