TÉCNICAS DE ANALISIS INSTRUMENTAL, 2º de Biotecnología

SERIE 7-Cromatografía

1) En una columna de HPLC de 25 cm de longitud y 0,4 cm de diámetro interno se obtuvieron

los siguientes datos para tres compuestos:
Compuesto tR (min) wb (min) k
A 8,04 0,15 5,76
B 8,26 0,15 ---
C 8.43 0,16 ----
Calcular: a) La eficacia de la columna; b) la resolución y la selectividad de la columna para cada
par de picos adyacentes; y c) La eficacia que debería tener la columna para conseguir una
resolución a línea de base de los compuestos B y C.

2) La determinación cromatográfica de los 20 aminoácidos proteicos se puede llevar a cabo por

cromatografía de intercambio catiónico utilizando una disolución reguladora de citratos como
fase móvil. Para el calibrado, se cromatografían una serie de disoluciones patrón mezcla de
dichos aminoácidos y se mide la altura de sus picos cromatográficos. Los resultados obtenidos
para el triptófano fueron los siguientes:
Concentración triptofano (mg/mL ) Altura de pico (cm)
0.30 2.00
0.60 3.91
0.90 5.95
1.20 8.00
1.50 9.50
1.80 11.50
Este calibrado se utilizó para determinar el contenido en triptofanos de una proteína durante
los estudios de caracterización de la misma. Para el análisis una muestra de 2.5 mg de la
proteína se somete a hidrólisis acida y se lleva a volumen de 10 mL con agua. Una alícuota de 1
mL de esta disolución se diluye (1:2) con la fase móvil y se cromatografía obteniéndose una
altura de pico para el triptofano de 6.90 cm. Calcular la concentración de triptofano en la
proteína.

3) La amoxicilina y la ampicilina pueden determinarse en plasma utilizando cromatografía

líquida en fase inversa con un detector uv-vis. Una muestra de suero que contiene los dos
antibióticos proporcionó un pico cromatográfico para la amoxicilina con un tiempo de
retención de 2.7 min y una anchura en la base de 30 s, y otro para la ampicilina a un tiempo de
retención de 4.2 min con una anchura en la base de 40 s.
a) Calcular el factor de capacidad para la amoxicilina y la ampicilina sabiendo que el
tiempo muerto es de 1.8 min.
b) Calcular la resolución e indicar si los picos están resueltos a línea base.
c) Para determinar amoxicilina y ampicilina por el método del patrón interno, a una
alícuota de 3.0 mL de plasma se le añaden 0.5 mL de una disolución de penicilina V de 10 mg/L,
se inyectan 20 mL de esta disolución en el cromatógrafo de líquidos y se obtienen los
siguientes datos:
 Compuesto Área
Amoxicilina 3654
Penicilina V 2501
Ampicilina 2848

Sabiendo que en la calibración con patrón interno se han obtenido factores de respuesta de
1.05 para la amoxicilina y 0.89 para la ampicilina, determine la concentración de antibióticos
en suero.

4) Se quiere determinar el contenido en nitratos y sulfatos en un suelo sometido a un proceso

experimental de fitoremediación mediante cromatografía iónica. Para ello, una muestra de 3.5
g del suelo en estudio se trata con 10 ml de ácido nitrico 0.1 M, se filtra y se lleva a volumen de
100 ml con agua. Una alícuota de 5 mL de esta disolución se ajusta a pH 5 con una disolución
reguladora y se lleva a volumen de 10 mL. 1 ml de la disolución resultante se diluye con la fase
móvil en proporción 1:1 y se inyecta en el cromatografo para su análisis. El cromatograma
obtenido presenta un área de pico de 79890 para nitrato y 28750 para sulfato. Paralelamente
se cromatografía una serie de disoluciones patrón mezcla de dichos aniones y se registró el
área de pico de ambos compuestos, obteniéndose los siguientes datos:
Concentración Area de pico Concentración Area de pico
nitrato (ppm ) nitrato sulfato (ppm) sulfato
0.5 26000 1.0 11998
1.0 52100 2.0 24005
2.0 105990 3.0 35899
3.0 159890 5.0 61100
Calcular la concentración de aniones en la muestra.

5) Proponer la metodología adecuada para la separación de las siguientes moléculas

empleadas como conservantes: ácido benzoico, p-hidroxibenzoico, ester metílico del p-
hidroxibenzoico, clorohidroxibenzoico y ácido sórbico en alimentos. Justificar el posible orden
de elución.

6) Se llevó a cabo la separación de las proteínas ferritina ( PM = 450000 Da) y transferrina (PM
= 80000 Da ) presentes en una disolución salina de NaCl utilizando una columna de exclusión
por tamaños BioGel P-300 (intervalo de fraccionamiento 40000-300000) de 37 cm de longitud
y 1.5 cm de diámetro interno. La detección se realizó espectrofotométricamente en fracciones
de 0.65 mL recogidas a la salida de la columna. La ferritina se detectó en la fracción 22 y la
transferrina en la fracción 32. Calcular el coeficiente de distribución de ambas proteínas ¿En
qué fracción aparecería el NaCl?.
7) Dado el cromatograma inferior y la calibración para una columna de exclusión por tamaños
(Ko= -0.2432log PM+1.5336) calcular:
a) la resolución de la misma entre la anhidrasa carbónica (CA) y la ovalbúmina (O)
sabiendo que el flujo a través de la misma es de 0.6 mL/min.
b) Cual será la longitud de la columna si la aprotinina (Apr) eluye en el limite de
penetración total y el diámetro de la columna es de 2 cm.
c) Estimar el peso molecular de una especie que eluye a 13.5 minutos sabiendo que el
límite de exclusión total es de 5 ml.