scGR-seq - Análisis Integrado de Glucano y ARN en Células Individuales - PMC

6/9/22, 13:21 scGR-seq: análisis integrado de glucano y ARN en células individuales - PMC
Protocolo ESTRELLA 18 de marzo de 2022; 3(1): 101179. PMCID: PMC8861808

Publicado en línea el 18 de febrero de 2022. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101179 PMID: 35243371
scGR-seq: análisis integrado de glucano y ARN en células individuales

Haruki Odaka , 1, 4 Haruka Ozaki , 2 y Hiroaki Tateno 1, 3, 5, ∗
Resumen
Los glicanos son molé culas estructuralmente diversas que se encuentran en la superficie de las
cé lulas vivas. El protocolo detalla un sistema desarrollado para el aná lisis combinado de glucano y
ARN en cé lulas individuales (scGR-seq) utilizando cé lulas madre pluripotentes inducidas por hu‐
manos (hiPSC) y cé lulas progenitoras neurales (NPC) derivadas de hiPSC. scGR-seq consta de per‐
files de glicanos basados en lectina con có digo de barras de ADN mediante secuenciació n (scGly‐
can-seq) y perfiles de transcriptomas unicelulares (scRNA-seq). scGR-seq será una té cnica esencial
para delinear la heterogeneidad celular de los glucanos en los sistemas multicelulares.
Para obtener detalles completos sobre el uso y la ejecució n de este perfil, consulte Minoshima et
al. (2021) .
Áreas temáticas: biología celular, cultivo celular, cé lula ú nica, genó mica, secuenciació n, RNAseq
Grá ficamente abstracto
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8861808/ 1/28
Antes de que empieces
El siguiente protocolo describe los pasos específicos para usar cé lulas madre pluripotentes indu‐
cidas por humanos (hiPSC) y cé lulas progenitoras neurales (NPC) derivadas de hiPSC. Sin em‐
bargo, tambié n hemos utilizado este protocolo en otras cé lulas, como fibroblastos dé rmicos hu‐
manos, neuronas derivadas de hiPSC y varias líneas celulares.
Este protocolo consta de tres pasos principales (Figura 1)-
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Figura 1
Diagrama esquemático de la secuenciació n de scGlycan/RNA
(A) Ilustració n de la lectina con có digo de barras de ADN.
(B) Ilustració n esquemática de scGlycan-seq, scRNA-seq y scGR-seq. Figura reimpresa con permiso de Minos‐
hima et al. (2021) .
(i) Glycan-seq de una sola cé lula (scGlycan-seq)
(ii) RNA-seq de una sola cé lula (scRNA-seq)
(iii) Aná lisis integrado de datos (scGR-seq)
Se requieren procedimientos de cultivo celular está ndar e incubadoras humidificadas para el

mantenimiento del cultivo celular.
Para scRNA-seq, usamos RamDA-seq, un mé todo de secuenciació n de ARN total de una sola cé lula
basado en placas ( Hayashi et al., 2018 ).
Utilizamos el secuenciador de pró xima generació n, MiSeq (Illumina) y el sistema de recuento de

ADN con có digo de barras ( Minoshima et al., 2021 ) para contar los có digos de barras de ADN
derivados de cada lectina.
Preparació n de la columna de azú car inmovilizada
Duración: 2 días Volver arriba
1. Lave 20 g de gel Sepharose CL-4B usando un filtro de vidrio en 500 ml de agua Milli-Q.
2. Suspender el gel Sepharose CL-4B en 30 ml de agua Milli-Q y agregar 3 ml de epiclorhidrina y
13 ml de NaOH 2 N seguido de incubació n a 40 °C durante 2 h con agitació n.
3. Lave la Sepharose CL-4B con 500 ml de agua Milli-Q.
4. Disolver 10 mmol de ligandos de azú car para lectinas (vertabla 1) en 80 mL de NaOH 0,1 M
(pH 13,0) y mezclar todo con Sepharose CL-4B activada con epoxi (preparada en el paso 3).
Incubar a 40 °C durante 24 h y luego lavar con 500 ml de agua Milli-Q.
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tabla 1
Listas de lectinas
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Nombre Especie Especificidad Secuencia de ADN oligo Columna de

(origen) aproximada azúcar
inmovilizad
utilizada
para la
purificación
1 rPVL Psathyrella Sia, GlcNAc CGACGCTCTTCCGATCTCTGTCGCC GlcNAc

velutina CTGAACAACGGCAATGGCAGTCAG
ATCGGAAGAGCACAC
2 SCN Sambucus α2-6Sia CGACGCTCTTCCGATCTCTGTGCCG Laca
nigra CTAGCCAGGGTTGGACTGTCAGAT
CGGAAGAGCACAC
3 SSA Sambucus α2-6Sia CGACGCTCTTCCGATCTCTGGCACT Laca
sieboldiana CGTTGCTGGGTCTGGGGACGTCAG
ATCGGAAGAGCACAC
4 TJAI Trichosanthes α2-6Sia CGACGCTCTTCCGATCTCTGACAG
Laca
japónica CTACTCGTGCGGGAAAGCAGTCAG
ATCGGAAGAGCACAC
5 rPSL1a Polyporus α2-6Sia CGACGCTCTTCCGATCTCTGGGTC
Laca
escamoso TGGGGTCAACTCCGTGGCGTGTC
AGATCGGAAGAGCACAC
6 rDiscoidinII Dictyostelium LacNAc, Galβ1- CGACGCTCTTCCGATCTCTGGGCG
Laca
dicodeum 3GalNAc (T), AAGTCTCAATCGGCGATCGGGTC
aGalNAc (Tn) AGATCGGAAGAGCACAC

7 rCGL2 Coprinopsis GalNAcα1-3Gal CGACGCTCTTCCGATCTCTGTGTG
Laca
cinerea (A), PoliLacNAc GCAGCCATTCGTTCCTCCGCGTC
AGATCGGAAGAGCACAC
8 rC14 Gallus gallus LacNAc CGACGCTCTTCCGATCTCTGACCC
Laca
domesticus ramificado AAGGCGATCTGACTGTCCACCGTC
AGATCGGAAGAGCACAC
9 GSLII Griffonia bisectriz de CGACGCTCTTCCGATCTCTGTCCT
GlcNAc
simplicifolia GlcNAc CCAAGGAGCCGCCACACCGTCA
GATCGGAAGAGCACAC
10 rSRL Sclerotium Core1,3, CGACGCTCTTCCGATCTCTGCGTG
GlcNAc
5. Resuspender la Sepharose CL-4B inmovilizada en azú car en 50 ml de monoetanolamina 1 M

(pH 8,0) e incubar a 37 °C durante la noche para bloquear el exceso de grupos epoxi.
6. Lave la Sepharose CL-4B inmovilizada en azú car con tampó n de acetato 0,1 M (pH 4,0)/NaCl
0,5 M y Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0)/NaCl 0,5 M.
7. Vuelva a suspender la Sepharose CL-4B inmovilizada en azú car en agua Milli-Q y guá rdela a 4
°C hasta su uso posterior. Volver arriba
8. Empaquete 1 ml de Sepharose CL-4B inmovilizada en azú car en columnas de cromatografía

Micro Bio-Spin y guá rdelas a 4 °C hasta su uso posterior.
Nota: 1 g de Sepharose gel contiene 0,5 mmol de grupos epoxi. La cantidad de gel a preparar
puede reducirse en función de la escala de purificación.
CRÍTICO: La epiclorhidrina es una sustancia tóxica.
Conjugació n de lectina con có digo de barras de ADN
Duración: 1 día
9. Mezcle 100 μL de lectina (1 mg/mL en PBS) con una concentració n de 10x de é ster de
dibencilciclooctino-N-hidroxisuccinimida fotoescindible (PC-DBCO-NHS) e incube a 20 °C
durante 1 hora en la oscuridad.
10 Agregue 10 l de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) e incube a 20 °C durante 15 min en la oscuridad para
bloquear el exceso de PC-DBCO-NHS.
11 Despué s de la incubació n, retire el PC-DBCO-NHS libre utilizando la columna miniatura de
desalinizació n G-25 (ver materiales y equipos ).
12 Añ adir 200 μM de 5′-azida-DNA (concentració n 10×, vertabla 1) a la PC-DBCO-lectina para
generar lectinas con có digo de barras de ADN.
Purificació n de lectinas con có digo de barras de ADN
Duración: 2 días
13 La columna de Sepharose CL-4B inmovilizada con azú car (1 ml en una columna en miniatura)
se lava con 1 ml de PBSE a 4°C.
14 Agregue 100 μL de PBSE a las soluciones de lectina con có digo de barras de ADN y aplíquelas
en la columna Sepharose CL-4B inmovilizada con azú car. Recuperar la fracció n de flujo
continuo (100 l).
15. Lave la columna Sepharose CL-4B inmovilizada con azú car con 400 l de PBSE tres veces.
Recuperar cada una de las fracciones de lavado (400 μL cada una).
dieci Agregar 400 μL de la solució n de elució n que comprende PBSE que contiene un azú car
sé is. apropiado para cada lectina (vertabla 1). Repita este paso tres veces. Recuperar cada una de
las fracciones de elució n (400 μL cada una).
17 Analizar las lectinas con có digo de barras de ADN por SDS-PAGE (Figura 2). Mezcle 4 μL de
cada fracció n de los pasos de purificació n (solo lectina, flujo continuo, lavado, elució n) con 4
μL de tampó n de muestra SDS. Volver arriba
Figura 2
Preparació n de lectinas con có digo de barras de ADN
(A) Ilustració n del proceso de reacció n para conjugar oligonucleó tidos de ADN a lectina.
(B) rBC2LCN muestra una sola banda a 16 kDa (carril 1). El rBC2LCN con có digo de barras de ADN exhibió
una banda de frotis de alto peso molecular a >140 kDa (carril 2). La escisió n de los có digos de barras de ADN
de rBC2LCN por exposició n UV colapsa el frotis al PM de rBC2LCN (16 kDa) (carril 3). Figura reimpresa con
permiso de Minoshima et al. (2021) .
18 Cargue 8 μL de las muestras, así como 5 μL de marcador de tamañ o de proteína preteñ ido en
gel SDSPAGE al 17 %. Ejecute el SDSPAGE utilizando el bú fer de ejecució n SDS a 100 V durante
20 min.
19 Mancha el gel SDSPAGE con GelRed seguido del protocolo del fabricante. Este paso puede teñ ir
tanto los có digos de barras de ADN conjugados con lectina como los libres de manchas.
20 Mancha el gel SDSPAGE con reactivos de tinció n de plata seguido por el protocolo del
fabricante. El gel utilizado para la tinció n GelRed se puede utilizar para la tinció n con plata.
21 Recupere las fracciones de elució n y dialice las lectinas purificadas con có digo de barras de
ADN frente a PBS 0,1x (para diá lisis) utilizando Tube-O-Dialyzer, Medi 8kD.
22 Concentrar las lectinas con có digo de barras de ADN utilizando un filtro centrífugo (Amicon
ultra 0,5 mL 10K) con un peso molecular de corte de 10 kDa.
23 Cuantifique la concentració n de proteína y ADN con el kit de reactivos Bradford y Quant-iT
OliGreen ssDNA, respectivamente, y determine la proporció n de ADN a lectina.
24 Mezcle 41 sondas con có digo de barras de ADN (5 μg/mL, concentració n final, para cada
lectina) (tabla 1) en un tubo de 1,5 mL y llene hasta 100 μL con PBS/BSA.
25 Guá rdelo a −30°C.
Nota: Se puede usar cualquier lectina para scGR-seq, pero recomendamos verificar si las lecti‐
nas no reaccionan entre sí mediante ensayos como la transferencia de lectina. Etiquetamos 41
sondas con códigos de barras de ADN (tabla 1), que cubren una amplia gama de glucanos
como los glucanos sialilados, galactosilados, manosilados, GlcNAcilados y fucosilados. Volver arriba
Precaución : Algunas lectinas se eluyen en fracciones de lavado. En este caso, recupere las frac‐
ciones de lavado y utilícelas para los experimentos.
Tabla de recursos clave
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REACTIVO o FUENTE IDENTIFICADOR

RECURSO
anticuerpos
Rató n PE antihumano BD Biociencias clon No. O18-1330

PAX6
PE Rató n anti-NESTIN BD Biociencias clon 25/NESTIN (RUO)

Rató n anti-Oct3/4 Santa Cruz Gato#sc-5279
Biotecnología, Inc.
Rató n anti-SSEA-4 Merck N.º de gato MAB4304

Burro anti-rató n IgG Thermo Fisher N.º de gato A21202
Alexa Fluor 488 Scientific
anticuerpo policlonal
(pAb)
Sustancias químicas, péptidos y proteínas recombinantes
PBS Fujifilm Wako Gato#045-29795

Pure Chemical Co.
EDTA Sigma-Aldrich Gato#09-1420-5

BSA Merck KGaA N.º de gato A3059
Tris-HCl Nacalai Tesque, N.º de gato 35434-21
Inc.
Na2HPO4 · 12H2O _ _ _ _ Fujifilm Wako Gato#196-02835

Pure Chemical Co.
NaCl Fujifilm Wako N.º de gato 191-01665

Pure Chemical Co.
KCl Fujifilm Wako Gato#163-03545

Pure Chemical Co.
KH 2 PO 4 Fujifilm Wako Gato#166-04255

Pure Chemical Co.
Agua libre de nucleasas QIAGEN Gato#129114

epiclorhidrina Nacalai Tesque, Gato#14415-05
Inc.
monoetanolamina Citiva N.º de gato BR-1000-50
Materiales y equipamiento
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Tampó n acetato 0,1 M (pH 4,0)/NaCl 0,5 M
Reactivo concentración final Monto
Trihidrato de acetato de sodio 0,1 millones 13,6g

NaCl 0,5 millones 29,22g
Nota: Disuelva trihidrato de acetato de sodio y NaCl con 500 mL de MilliQ, ajuste el pH a 4,0
con ácido acético y llene hasta 1 L con MilliQ.
Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0)/NaCl 0,5 M
Tris-HCl 0,1 millones 12,1g

NaCl 0,5 millones 29,22g
Nota: Disuelva Tris-HCl y NaCl con 500 mL de MilliQ, ajuste el pH a 4,0 con ácido acético y
llene hasta 1 L con Milli Q.
Tampó n de muestra SDS
Tris-HCl 1 M (pH 6,8) 0,125 M 1,25 ml

SDS 4% 4g
sacarosa 10% 1 gramo
azul de bromofenol 0.004% 0,4 miligramos
Nota: Llene hasta 10 ml con MilliQ.
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Bú fer de ejecució n de SDS
Tris-HCl 25 mm 3,03g
Glicina 192 mm 14,4 gramos
SDS 0,1% 1 gramo
Nota: Llene hasta 10 ml con MilliQ.
PBS (para diálisis)
Na₂HPO₄·12H₂O 5,86 mm 2,1 gramos

NaCl 130 mm 8g
KCl 2,7 mm 0.2g
KH₂PO₄ 1,48 mm 0.2g
EDTA 1 mm 3,72g
Nota: Llene hasta 1 L con MilliQ.
PBSE
Na₂HPO₄·12H₂O 5,86 mm 2,1 gramos

NaCl 130 mm 8g
KCl 2,7 mm 0.2g
KH₂PO₄ 1,48 mm 0.2g
EDTA 1 mm 3,72g
Nota: Llene hasta 1 L con MilliQ.
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Columna miniatura desalinizadora G-25
Sephadex G-25 fino n/A 0,8 ml

Columnas de cromatografía Micro Bio-Spin n / A n/A
Nota: Lave Sephadex G-25 fine con TBS y dispense 0,8 ml de Sephadex G-25 fine en la columna
y guárdela a 4 °C.
PBS/BSA
PBS n/A n/A

BSA 1% 10 gramos
Total n/A 1L
Nota: Filtre el reactivo con una membrana de PVDF de 0,22 μm y guárdelo a 4 °C.
PBS/BSA/ CaCl2
PBS/BSA n/A 1L
CaCl2 _ 1 mm N/A
Total n/A 1L
Medio de inducció n neural STEMdiff™/suplemento de inducció n neural SMADi
Medio de inducció n neuronal STEMdiff™ n/A 250 ml

Suplemento de inducció n neural STEMdiff™ SMADi n / A 0,5 ml
Total n/A 250,5 ml
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Nota: alicuotar y almacenar a −20°C; sin embargo, puede almacenarse entre 2 °C y 8 °C du‐
rante un máximo de 2 semanas si no se usa de inmediato.
Detalles del método paso a paso
Cultivo celular de hiPSCs
Tiempo: 3–4 días
CRÍTICO: realice todos los experimentos de cultivo celular dentro de un gabinete de bio‐
seguridad y use equipo de protección personal, incluidos guantes y gafas.
1. Cubra cada pocillo de la placa de 6 pocillos con 1 ml de Matrigel y dé jelo reposar a

temperatura ambiente (TA) durante 1 hora.
2. Descongele los medios mTeSR Plus a 37 °C durante 5 a 15 min. Coloque la cantidad adecuada
de hiPSC 201B7 en una placa de 6 pocillos que contenga 2 ml del medio mTeSR Plus.
3. Cultive las cé lulas durante 2 a 3 días en una incubadora de CO 2 (con el nivel de CO 2 establecido en
5 %).
4. Recupere las cé lulas con un reactivo de disociació n celular suave y vuelva a suspenderlas en
los medios mTeSR Plus complementados con Y-27632 10 μM.
Punto de pausa: las hiPSC se suspenden en medio de crioconservación mFreSR y se al‐

macenan en nitrógeno líquido.
Generació n de células progenitoras neurales (NPC) derivadas de hiPSC
Duración: 11 días
5. Descongele el medio de inducció n neuronal STEMdiff™ y el suplemento de inducció n neuronal

STEMdiff™ SMADi a temperatura ambiente (15°C–25°C) o durante la noche (2°C–8°C). Agitar
ambos medios a fondo.
6. Agregue 0,5 ml de STEMdiff™ SMADi Neural Induction Supplement a 250 ml de STEMdiff™
Neural Induction Medium (NIM). Mé zclelos bien y calié ntelos a temperatura ambiente antes de
usarlos.
7. Cubra cada pocillo de la placa de 6 pocillos con 1 ml de Matrigel y dé jelo reposar a
temperatura ambiente durante 1 h.
8. Lave bien el hiPSC cultivado con 2 ml de solució n salina tamponada con fosfato (PBS). Volver arriba
9. Agregue 1 ml de reactivo de disociació n celular suave e incube a 37 °C durante 8 a 10 min.

10 Pipetee hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para disociar los agregados celulares. Recoja
las cé lulas en un tubo có nico de 15 mL.
11 Lave la placa con 2 ml de PBS y recoja las cé lulas restantes en un tubo có nico de 15 ml.
12 Cuente las cé lulas viables con un hemocitó metro utilizando el mé todo de tinció n azul Trypan.
13 Centrifugar el tubo có nico de 15 ml a 300 × g durante 4 min. Aspire y deseche el sobrenadante
sin perturbar el sedimento celular.
14 Vuelva a suspender los sedimentos celulares con NIM complementado con Y-27632 10 μM para
lograr una concentració n final de 1 × 10 6 cé lulas/mL.
15. Aspire el Matrigel de una placa de 6 pocillos y agregue 2 ml de suspensió n celular (2 × 10 6
cé lulas/pozo) en un solo pocillo de la placa recubierta de Matrigel.
dieci Incubar las cé lulas a 37°C, 5% CO 2 durante 11 días. Fresh NIM sin Y-27632 se usa para
sé is. cambios de medio cada dos días.
17 Aspirar los medios de las placas, agregar 1 ml de Accutase por pocillo e incubar a 37 °C, CO 2 al
5 % durante 5 min.
18 Recoja la suspensió n celular en un tubo có nico de 15 mL. Lave las placas con 2 ml de medio
DMEM/F12 precalentado y recoja el residuo en el mismo tubo. Centrifugar la suspensió n
celular a 300 × g durante 4 min y el sedimento celular resultante se resuspende en NIM y se
utiliza para la evaluació n del estado de diferenciació n mediante qRT-PCR y tinció n de
fluorescencia de marcadores hiPSC (POU5F1) y marcadores NPC (SOX1, NESTIN , PAX6,
FOXG1).
Punto de pausa: los NPC derivados de hiPSC se suspenden en medio de crioconserva‐

ción mFreSR y se almacenan en nitrógeno líquido.
Glicano-seq de una sola célula
Duración: 2 días
CRÍTICO: La contaminación con ADN y ADNasa afectará significativamente los experi‐

mentos. Realice todos los experimentos dentro de un gabinete de bioseguridad en la oscuridad
y use equipo de protección personal, incluidos guantes y gafas. Tenga mucho cuidado al mani‐
pular todos los reactivos para evitar la contaminación con ADN y ADNasa. Prepare y dispense
todos los reactivos en hielo a menos que se indique lo contrario.
19 Incubar las cé lulas con lectinas con có digo de barras de ADN.
una. Tomar 1 × 10 5 cé lulas en un microtubo de 1,5 mL y centrifugar a 600 × g durante 4 min a 4

°C.
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b. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de PBS/BSA. Repita el paso

de lavado dos veces.
C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en 90 μL de PBS/BSA/CaCl 2 que contenga
10 μL de mezcla de lectina con có digo de barras de ADN (5 μg/mL de cada lectina, 10 μL).
d. Incubar las cé lulas en hielo durante 1 h en la oscuridad y luego centrifugar a 600 × g
durante 4 min a 4 °C.
mi. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de PBS/BSA/CaCl 2 . Repita
el paso de lavado tres veces.
F. Agregue 200 μL de PBS/BSA/CaCl 2 y cuente el nú mero de cé lulas.
CRÍTICO: se debe agregar CaCl 2 en la solución cuando usa lectinas, que requieren calcio para la actividad
de unión de glicanos.
20 Dispensar cé lulas individuales en tubos.
una. Dispense cé lulas individuales en la tapa de tiras ó pticas planas de 8 tapas (para tubos de 0,2
ml) seleccioná ndolas manualmente con el sistema TOPick I Live Cell Pick u otros mé todos.
b. Cubra los tubos con la tapa que contiene cé lulas individuales, gire hacia abajo y manté ngalos
en hielo.
21 Exponga las cé lulas a la luz ultravioleta durante 15 minutos usando la lá mpara de banco UVP
Blak-Ray XX-15L UV para liberar los có digos de barras de ADN de las lectinas.
22 Centrifugar a 3.549 × g durante 30 s a 4 °C y transferir el sobrenadante a una nueva tira de 8
tubos de 0,2 ml, mantenida en hielo.
CRÍTICO: Tenga cuidado de no tocar las células con la punta de la pipeta. Puede dejar
0,5 μL de sobrenadante en el tubo.
Punto de pausa: el sobrenadante se puede almacenar a -80 °C.
23 Agregue 2,5 l de tampó n de lisis celular en el tubo y cubra el tubo con una tapa.
24 Centrifugue y almacene a -80 °C para secuencias de ARN de una sola cé lula (consulte la
siguiente secció n " secuencia de ARN de una sola cé lula ".
25 Realice PCR para amplificar los có digos de barras de ADN para la secuenciació n.
una. Prepare la mezcla de PCR de la siguiente manera: cada muestra contiene 25 μL de volumen
de reacció n total: 9,75 μL de sobrenadante (plantilla), 12,5 μL de NEBNext UltraII Q5 Master
Mix, 0,25 μL de cebador índice i5 (100 mM) y 2,5 μL de i7 cebador índice (10 mM).
b. Realice las reacciones de PCR de la siguiente manera.
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Condiciones de ciclo de PCR
Pasos La temperatura Tiempo Ciclos
Desnaturalizació n inicial 98°C 45 segundos 1

desnaturalizació n 98°C 10 segundos 25–35 ciclos
Recocido y extensió n 65°C 50s
Extensió n final 65°C 5 minutos 1
Mantener 4°C Siempre
26 Purificar los productos de PCR.
una. Combine 16 muestras en un microtubo de 1,5 ml.

b. Agregue 320 μL de AMPure y pipetee suavemente el contenido 10 veces.
C. Despué s de la incubació n a temperatura ambiente durante 5 min, exponga los tubos al
soporte magné tico durante 2 min.
d. Deseche los sobrenadantes sin perturbar las perlas magné ticas en el soporte magné tico.
mi. Agregue 1 ml de etanol al 80 % en el microtubo de 1,5 ml seguido de incubació n a
temperatura ambiente durante 30 s en el soporte magné tico. Deseche el sobrenadante y
repita el paso de lavado tres veces.
F. Seque al aire las perlas magné ticas a temperatura ambiente durante 10 min.
CRÍTICO: Cuando las cuentas se secan, el color de las cuentas se vuelve más claro.
Si se secara demasiado, sería difícil de eluir.
gra Retire el microtubo de 1,5 ml del soporte magné tico y agregue 160 l de Tris 10 mM (pH 8,5).
mo.
H. Pipetear suavemente el contenido 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 2
min.
i. Exponga el tubo al soporte magné tico y recoja con cuidado el sobrenadante en un tubo de
15 ml.
27 Concentrar los productos de PCR.
una. Agregue 5 volú menes de DNA Binding Buffer al tubo de 15 ml y mezcle brevemente con
vortex.
b. Transfiera la mezcla a un tubo de recolecció n que contenga una columna Zymo-Spin.
C. Centrifugar durante 30 s y desechar el flujo continuo.
d. Agregue 200 μL de DNA Wash Buffer a la columna y centrifugue durante 30 s. Repita el
paso de lavado.
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mi. Agregue 20 μL de tampó n de elució n de ADN directamente a la matriz de la columna e

incube a temperatura ambiente durante 1 min. Transfiera la columna a un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugue a 20 400 × g durante 30 s a 4 °C para eluir el ADN.
28 Utilice 6,5 μL de la fracció n de elució n para analizar el tamañ o y la cantidad de los productos
de PCR, utilizando el sistema de electroforesis de microchip, MultiNA con el kit DNA-500, de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aparecerá una sola banda entre 150 y 175 pb si
la biblioteca de ADN se construye con éxito.
Punto de pausa: la biblioteca de ADN se puede almacenar a -20 °C.
Alternativas: Para el análisis del tamaño y la cantidad de los productos de PCR, se podría
considerar Agilent Bioanalyzer o Agilent TapeStation.
29 Desnaturalizació n del ADN de la biblioteca
(para > 4 nM de ADN de biblioteca)
una. Diluya la concentració n de la biblioteca de ADN a 4 nM con agua libre de nucleasas y

mé zclela en cantidades iguales.
b. Mezcle 4 μL de la mezcla de ADN de la biblioteca de todas las muestras con 4 μL de NaOH
0,1 N, agitando brevemente en vó rtex y centrifugando.
C. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y mantenerlos en hielo.
d. Agregue 4 μL de ADN de biblioteca 2 nM a 796 μL de HT1 preenfriado para obtener un total
de 800 μL (10 pM) de ADN de biblioteca. Mezcle brevemente con vó rtex y centrifugue.
(para < 4 nM de ADN de biblioteca)
mi. Mezcle cada biblioteca de ADN en cantidades iguales

F. Mezcle 2 μL de la mezcla de ADN de la biblioteca de todas las muestras con 2 μL de NaOH
0,1 N, agitando brevemente en vó rtex y girando hacia abajo.
gra Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y mantenerlos en hielo.
mo.
H. Agregue 2 μL de Tris-HCl 200 mM (pH 7,0) y mezcle brevemente con un vó rtex y
centrifugue.
i. Agregue 6 μL de ADN de biblioteca a 534 μL de HT1 preenfriado para un total de 540 μL de
ADN de biblioteca. Mezcle brevemente con vó rtex y centrifugue.
30 PhiX desnaturalizante
una. Mezcle 1 l de PhiX 10 nM, 4 l de agua libre de nucleasas y 5 l de NaOH 0,1 N para un total de
10 l, 1 nM de Phix. Mezcle brevemente con vó rtex y centrifugue.
b. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y enfriar en hielo. Volver arriba
C. Mezcle 2 l de PhiX desnaturalizado 1 nM y 248 l de HT1 preenfriado para un total de 250 l

(8 pM PhiX). Mezcle brevemente con vó rtex y centrifugue.
31 Mezcle 540 μL de ADN de biblioteca (paso 29) con 130 μL de 8 pM PhiX (paso 30).
32. Calentar a 96 °C durante 2 min y enfriar en hielo inmediatamente seguido de incubació n
durante 5 min.
33. Cargue 600 μL de la mezcla de bibliotecas en el cartucho de reactivos del kit de reactivos MiSeq
y ejecute la configuració n de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
RNA-seq de una sola célula
Tiempo: 1–2 días
CRÍTICO: La contaminación con ARNasa y ADN afectará significativamente los experi‐

mentos. Realice todos los experimentos dentro de un gabinete de bioseguridad en la oscuridad
y use equipo de protección personal, incluidos guantes, máscaras y gafas. Limpie todos los ins‐
trumentos utilizados para el experimento, es decir, pipeta, centrifugadora, mezcladora, termo‐
ciclador, mesa de laboratorio, con eliminador de RNase –RnaseAway. Tenga mucho cuidado al
manipular todos los reactivos para evitar la contaminación con RNasa. Para inactivar la
RNasa y mantener la actividad enzimática, prepare y dispense todos los reactivos en hielo, a
menos que se indique lo contrario.
34. Prepare la biblioteca de ADNc utilizando un mé todo de secuenciació n de ARN total de longitud
completa, secuenciació n de amplificació n de desplazamiento aleatorio (RamDA-seq), a partir de
cé lulas individuales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
35. Cuantifique el ADN de la biblioteca a partir de muestras individuales derivadas de cé lulas
individuales, utilizando el sistema de electroforesis de microchip, MultiNA con el kit DNA-
12000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aparecerá una banda de 150 a 600 pb
si la biblioteca de ADN se construye con éxito.
36. Reú na y mezcle cada biblioteca de ADN y transfiera 50–100 fmol a un tubo de 1,5 ml.
37. Secuenciar el ADN de la biblioteca mixta utilizando un secuenciador de pró xima generació n
como Novaseq6000 de acuerdo con las pautas del secuenciador.
Resultados esperados
Una salida exitosa de scGR-seq asciende a aproximadamente 5000 del total de recuentos de có di‐
gos de barras de ADN. En el caso de scRNA-seq, deberían detectarse aproximadamente 10.000 ge‐
nes. En UMAP, las hiPSC y las NPC se separan en dos grupos en funció n de los datos de Glycan-seq
y RNA-seq (figura 3). La lectina específica de hiPSC, rBC2LCN, muestra una mayor unió n a hiPSC
que a NPC (Figura 4A). Por el contrario, rBanana muestra una mayor unió n a NPC que hiPSC (
Volver arriba
Figura 4A). hiPSCs muestran una mayor expresió n de genes específicos de hiPSC como NANOG y
POU5F1 (Figura 4B); en comparació n, los NPC muestran una mayor expresió n de genes marcado‐
res de NPC como NES (NESTIN), PAX6 y SOX1 (Figura 4B).
figura 3
Visualizació n UMAP para hiPSC y NPC
(A-C) Gráfica UMAP basada en (A) solo los datos de scRNA-seq y (B) solo los datos de scGlycan-seq, y (C) los da‐
tos de scRNA-seq y scGlycan-seq (scGR-seq) de hiPSC (n = 53, rojo) y NPC (n = 43, verde). Figura reimpresa con
permiso de Minoshima et al. (2021) .
Figura 4
Expresió n de marcador celular en datos de scRNA-seq y scGlycan-seq
(A) Gráficos de violín de datos de scGlycan-seq.
(B) Gráficos de violín de 41 expresió n génica marcadora de células seleccionadas en datos de scRNA-seq. Rectán‐
gulo rojo: marcador iPSC, Rectángulo verde: marcador NPC. Figura reimpresa con permiso de Minoshima et al.
(2021) .
Volver arriba
Cuantificació n y aná lisis estadístico
Preprocesamiento de datos
Nuestro software desarrollado internamente, Barcode DNA counting system (Mizuho Information
& Research Institute, Inc., Tokio, Japó n), procesó la lectura de Glycan-seq en el formato FASTQ, al
que se puede acceder desde github ( https://github. com/bioinfo-tsukuba/barcode-dna-counting-
system ). Cada secuencia de lectura se alinea con la referencia del có digo de barras de ADN que
corresponde a cada lectina en este sistema. Se acomodaron al má ximo dos desajustes en la regió n
lateral y un desajuste en la regió n media. Como resultado, los datos de conteo del có digo de ba‐
rras de ADN en cada celda son una lectura. Cada recuento de lectina se normaliza con el recuento
total del có digo de barras de ADN y se expresa como % del recuento total.
Alternativas: se podría considerar una interfaz de línea de comandos como PoolQ.
El procesamiento de la lectura de scRNA-seq en formato FASTQ se realizó con Subio Platform

(versió n 1.24.5849) de acuerdo con las pautas del fabricante. La plataforma Subio puede conver‐
tir los datos FASTQ en una matriz de expresió n gé nica de conteo sin procesar y transcripciones
por milló n (TPM), utilizando una canalizació n compuesta por fastp (versió n 0.20.0), HISAT2 (ver‐
sió n 2.1.0) y StringTie (versió n 2.1.1) Tener una interfaz grá fica de usuario tanto en Windows 10
como en Mac.
Control de calidad
Los datos de conteo extremadamente bajos pueden inducir un sesgo de datos en scGlycan-seq; es
necesario verificar si el nú mero total de có digos de barras influye en el componente 1 o el compo‐
nente 2 obtenido del aná lisis de componentes principales (Figura 5A). Si se detecta el sesgo de‐
pendiente del conteo total, entonces se determina un valor de corte del conteo total del có digo de
barras mediante el mé todo de Otsu usando R con paquetes tidyverse de la siguiente manera (
Otsu, 1979 ) (Figura 5B).
1. Declaració n de funció n del mé todo de Otsu
umbral_otsu <- function(x, log10transform=FALSE){
si (log10transformar){
x_original <- x
x <- log10(x)
} Volver arriba
n <- longitud(x)
segundo_má x <- sort(x, parcial=n-1)[n-1]
espacio_bú squeda <- ordenar(x)[-longitud(x)]
sigma <- 0
th <- 0
for(th_now en search_space){
clase0 <- x[x <= th_now]
clase1 <- x[x > th_now]
w0 <- longitud(clase0)
w1 <- longitud (clase1)
mu0 <- suma(clase0) / w0
mu1 <- suma(clase1) / w1
sigma_ahora <- w0 ∗ w1 ∗ (mu0 - mu1)ˆ2
si (sigma < sigma_ahora){
sigma <- sigma_ahora
th <- th_ahora
}
}
si (log10transformar){
th <- x_original[coincidencia(th, x)]
}
return(lista(sigma=sigma, umbral=th))
}
Volver arriba
2. Cargar datos de conteo total
df1 <- read_tsv("rawdata.tsv") #Reemplace rawdata.tsv con su nombre de archivo de

datos
df1 %>%
filter(! ID de có digo de barras %in% c("mIgG", "gIgG") ) %>%
seleccione (- ID de có digo de barras) %>%
como.matriz() -> mat1
dft <- tibble(Sample_ID = colnames(mat1), Total_count = colSums(mat1))
3. Realice la binarizació n en datos de conteo total transformados por log10 con el mé todo de
Otsu
res_otsu <- umbral_otsu(dft$Total_count, log10transform = TRUE)
imprimir(res_otsu$umbral)
tabla(dft$Total_count > res_otsu$umbral)
4. Visualizació n de datos de conteo total binarizados
n_aceptado = sum(dft$Total_count > res_otsu$umbral)
n_rejected = sum(dft$Total_count <= res_otsu$threshold)
eps %>%
mutate(filtrado = Total_count > res_otsu$threshold) %>%
ggplot(aes(reordenar(Sample_ID, Total_count), Total_count)) +

Volver arriba
geom_point(aes(color = filtrado)) +
geom_hline(yintercept=res_otsu$umbral) +
tema_bw() +
escala_color_discreto(
nombre="Filtrado",
descansos=c(VERDADERO, FALSO),
etiquetas=c(sprintf("Recuento total > %d (n=%d)", res_otsu$umbral, n_aceptado),
sprintf("Recuento total <= %d (n=%d)", res_otsu$umbral, n_rechazado))) +
laboratorios(x="") -> g
parcela(g)
Figura 5
Ejemplo de control de calidad de scGlycan-seq
(A) Ejemplo de conjunto de datos total de scGlycan-seq sesgado por có digo de barras. Gráfica de análisis de com‐
ponentes principales (PCA) de datos de scGlycan-seq de 96 fibroblastos ( izquierda ). Gráfico de dispersió n del
componente 1 (PC1) o del componente 2 (PC2) del análisis de componentes principales y el recuento total de có ‐
digos de barras ( centro , derecha ). El componente 1 muestra el sesgo total dependiente del conteo.
(B) Histograma del recuento total de có digos de barras. La línea negra indica el valor de corte que se calcula me‐
diante el método de Otsu usando R. Figura reproducida con permiso de Minoshima et al. (2021) .
En los datos de scRNA-seq, las cé lulas con datos de baja calidad está n determinadas por varios
pará metros, como el recuento de lecturas, el recuento de genes o la relació n de lectura mitocon‐
drial con el paquete Seurat R (versió n 4.02). Las cé lulas muertas/dañ adas exhibieron un bajo re‐
cuento de lecturas y una mayor proporció n de lecturas mitocondriales, mientras que las cé lulas
Volver arriba
agregadas mostraron un recuento de lecturas anormalmente alto. Dado que un valor de corte ó p‐
timo para excluir celdas de baja calidad depende del tipo de celda, la profundidad de lectura y la
calidad de lectura, debe determinarse por conjunto de datos individuales.
Análisis de datos integrado
El paquete Seurat R realiza la reducció n de la dimensionalidad, el agrupamiento celular y la identi‐

ficació n de la expresió n gé nica diferencial y, por lo tanto, puede usarse para analizar datos de
scGlycan-seq y scRNA-seq. La plataforma Seurat tambié n admite el aná lisis integrado de scGlycan-
seq y scRNA-seq basado en el flujo de trabajo del vecino má s cercano ponderado (wnn). En ( Hao
et al., 2021 ) se describe un protocolo detallado para el paquete Seurat R.
Limitaciones
Al igual que la citometría de flujo y la micromatriz de lectina, las cantidades absolutas de glicanos
y las estructuras precisas de los glicanos no se pueden determinar directamente a partir de las in‐
tensidades de señ al descritas anteriormente. Otra limitació n del sistema actual es el rendimiento.
Dado que scGR-seq es una plataforma basada en placas, el procesamiento del nú mero de cé lulas
se limita a cientos de cé lulas, mientras que puede realizar una secuenciació n de ARN total de lon‐
gitud completa ( Hayashi et al., 2018 ). Por el contrario, los mé todos basados en gotas, como 10×
Genomics (CITE-seq), pueden secuenciar miles de cé lulas a la vez, pero se dirigen solo a los extre‐
mos 3′ de las transcripciones de poli(A) ( Baran-Gale et al., 2018 ).
Solució n de problemas
Problema 1
La proporció n molar del có digo de barras de ADN en relació n con la lectina es demasiado baja (
paso 23 de " purificació n de lectinas con có digo de barras de ADN ").
Solucion potencial
Aumente la cantidad de PC-DBCO-NHS y el tiempo de incubació n.
Problema 2
Las cé lulas pueden aglutinarse parcialmente despué s de la incubació n con lectinas con có digo de
barras de ADN ( paso 19 de “ single cell glycan-seq ”).
Solucion potencial
Volver arriba
Las cé lulas pueden aglutinarse durante la incubació n con lectinas con có digo de barras de ADN.
Los agregados celulares se pueden eliminar utilizando un filtro de 100 μm. En el picking manual,
las celdas individuales se pueden seleccionar mediante inspecció n visual. En FACS, la selecció n con
FSC-H y FSC-W puede excluir del aná lisis las cé lulas agregadas.
Problema 3
No se detecta ninguna banda cuando los có digos de barras de ADN obtenidos de cada cé lula indi‐
vidual se ejecutaron en el sistema de electroforesis de microchip, MultiNA ( paso 28 de " seq de
glucano de cé lula ú nica ").
Solucion potencial
Se recomienda incluir muestras a granel (1 × 10 4 cé lulas) como control positivo para validar las
reacciones de PCR. Si la banda se detecta solo en muestras a granel, es probable que la cantidad
de có digos de barras de ADN obtenidos de cada cé lula individual sea demasiado baja. Incluso en
ese caso, puede ser detectable en un secuenciador de ú ltima generació n como Miseq si sigue el
protocolo del "paso 29: Desnaturalizació n del ADN de la biblioteca si la concentració n del ADN de
la biblioteca es < 4 nM".
Problema 4
La cantidad de biblioteca de cDNA obtenida de cada cé lula individual es inferior a 50–100 fmol
(paso 35 de “ single cell RNA-seq ”).
Solucion potencial
Mantenga un espacio experimental limpio para evitar la degradació n del ARN por contaminació n
con ARNasa.
Confirme que el etanol se seca despué s de los pasos de lavado de las perlas AMPure, ya que el
etanol domé stico puede inhibir las reacciones posteriores.
Increase the number of PCR cycle.
Remove low yield samples from sequencing analysis with Next-generation sequencer.
Include whole volume of low yield samples into the mixed cDNA library.
Problem 5
Volver arriba
High amount of primer dimers is detected around 110–130 bp when cDNA library obtained from
each single-cell were run on the microchip electrophoresis system, MultiNA (“single cell RNA-seq”
step 35).
Potential solution
It is recommended to remove primer dimers by size-selection of DNA fragments with AMPure XP

beads because primer dimers will compete with cDNA to bind flow cell in Next-generation sequen‐
cer. The addition of 1.0–1.2 times the volume of AMPure XP to the PCR reaction solution is suffi‐
cient to remove 110–130 bp fragments. Note that this selection step may slightly reduce short
cDNA fragments around 150 bp.
Resource availability
Lead contact
Further information and requests for resources and reagents should be directed to and will be
fulfilled by the lead contact, Hiroaki Tateno (h-tateno@aist.go.jp).
Materials availability
Recombinant lectins are available from FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation or the lead
contact upon request.
Acknowledgments
This work was supported by JST PRESTO (JPMJPR16F6), JST A-STEP (JPMJTR20UD), JST-CREST
(JPMJCR17H2), and AMED-Prime (21gm6010018h0004) awarded to H.T. This research was also
supported by AMED Moonshot Research and Development Program (JP21zf0127005) awarded to
H.O.
Author contributions
H.T. designed research and wrote the paper. H. Odaka developed the experimental methods and
wrote the paper. H. Ozaki developed the data analytical methods.
Declaration of interests
The authors declare no competing interests.
Footnotes
Volver arriba
Supplemental information can be found online at https://doi.org/10.1016/j.xpro.2022.101179.
Supplemental information
Table S1. Primer sequence:
Click here to view.(13K, xlsx)
Data and code availability
The code of the barcode DNA counting system is available from github
(https://github.com/bioinfo-tsukuba/barcode-dna-counting-system).
References
1. Baran-Gale J., Chandra T., Kirschner K. Experimental design for single-cell RNA sequencing. Brief Funct. Genomics.
2018;17:233–239. doi: 10.1093/bfgp/elx035. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
2. Hao Y., Hao S., Andersen-Nissen E., Mauck W.M., 3rd, Zheng S., Butler A., Lee M.J., Wilk A.J., Darby C., Zager M., et al.
Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021;184:3573–3587.e29. doi: 10.1016/j.cell.2021.04.048. [PMC
free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
3. Hayashi T., Ozaki H., Sasagawa Y., Umeda M., Danno H., Nikaido I. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers
dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nat. Commun. 2018;9:619. doi: 10.1038/s41467-018-02866-0. [PMC
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4. Minoshima F., Ozaki H., Odaka H., Tateno H. Integrated analysis of glycan and RNA in single cells. iScience.
2021;24:102882. doi: 10.1016/j.isci.2021.102882. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
5. Otsu N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man Cyb. 1979;9:62–66.
doi: 10.1109/Tsmc.1979.4310076. [CrossRef] [Google Scholar]
6. Tateno H., Toyota M., Saito S., Onuma Y., Ito Y., Hiemori K., Fukumura M., Matsushima A., Nakanishi M., Ohnuma K., et al.
Glycome diagnosis of human induced pluripotent stem cells using lectin microarray. J. Biol. Chem. 2011;286:20345–
20353. doi: 10.1074/jbc.M111.231274. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
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scGR-seq - Análisis Integrado de Glucano y ARN en Células Individuales - PMC

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6/9/22, 13:21 scGR-seq: análisis integrado de glucano y ARN en células individuales - PMC

Protocolo ESTRELLA 18 de marzo de 2022; 3(1): 101179. PMCID: PMC8861808

scGR-seq: análisis integrado de glucano y ARN en células individuales

Grá ficamente abstracto

Antes de que empieces

Este protocolo consta de tres pasos principales (Figura 1)-

Diagrama esquemático de la secuenciació n de scGlycan/RNA

(A) Ilustració n de la lectina con có digo de barras de ADN.

(i) Glycan-seq de una sola cé lula (scGlycan-seq)

(ii) RNA-seq de una sola cé lula (scRNA-seq)

(iii) Aná lisis integrado de datos (scGR-seq)

Se requieren procedimientos de cultivo celular está ndar e incubadoras humidificadas para el

Utilizamos el secuenciador de pró xima generació n, MiSeq (Illumina) y el sistema de recuento de

Preparació n de la columna de azú car inmovilizada

Duración: 2 días Volver arriba

Nombre Especie Especificidad Secuencia de ADN oligo Columna de

1 rPVL Psathyrella Sia, GlcNAc CGACGCTCTTCCGATCTCTGTCGCC GlcNAc

aGalNAc (Tn) AGATCGGAAGAGCACAC

5. Resuspender la Sepharose CL-4B inmovilizada en azú car en 50 ml de monoetanolamina 1 M

8. Empaquete 1 ml de Sepharose CL-4B inmovilizada en azú car en columnas de cromatografía

CRÍTICO: La epiclorhidrina es una sustancia tóxica.

Conjugació n de lectina con có digo de barras de ADN

Purificació n de lectinas con có digo de barras de ADN

Preparació n de lectinas con có digo de barras de ADN

Tabla de recursos clave

REACTIVO o FUENTE IDENTIFICADOR

Rató n PE antihumano BD Biociencias clon No. O18-1330

PE Rató n anti-NESTIN BD Biociencias clon 25/NESTIN (RUO)

Rató n anti-SSEA-4 Merck N.º de gato MAB4304

Sustancias químicas, péptidos y proteínas recombinantes

PBS Fujifilm Wako Gato#045-29795

EDTA Sigma-Aldrich Gato#09-1420-5

Na2HPO4 · 12H2O _ _ _ _ Fujifilm Wako Gato#196-02835

NaCl Fujifilm Wako N.º de gato 191-01665

KCl Fujifilm Wako Gato#163-03545

KH 2 PO 4 Fujifilm Wako Gato#166-04255

Agua libre de nucleasas QIAGEN Gato#129114

monoetanolamina Citiva N.º de gato BR-1000-50

Tampó n acetato 0,1 M (pH 4,0)/NaCl 0,5 M

Reactivo concentración final Monto

Trihidrato de acetato de sodio 0,1 millones 13,6g

Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0)/NaCl 0,5 M

Reactivo concentración final Monto

Tris-HCl 0,1 millones 12,1g

Tampó n de muestra SDS

Reactivo concentración final Monto

Tris-HCl 1 M (pH 6,8) 0,125 M 1,25 ml

Nota: Llene hasta 10 ml con MilliQ.

Bú fer de ejecució n de SDS

Reactivo concentración final Monto

Nota: Llene hasta 10 ml con MilliQ.

PBS (para diálisis)

Reactivo concentración final Monto

Na₂HPO₄·12H₂O 5,86 mm 2,1 gramos

Nota: Llene hasta 1 L con MilliQ.

Reactivo concentración final Monto

Na₂HPO₄·12H₂O 5,86 mm 2,1 gramos

Nota: Llene hasta 1 L con MilliQ.

Columna miniatura desalinizadora G-25

Reactivo concentración final Monto

Sephadex G-25 fino n/A 0,8 ml

Reactivo concentración final Monto

PBS n/A n/A