LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

5BV1

EXTRACCIÓN DE ADN DE BACTERIAS

PRÁCTICA 1

CUANTIFICACIÓN DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y

VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA
PRÁCTICA 2

EQUIPO #2

MARMOLEJO PÉREZ OMAR

MENDEZ VIRAMONTES CLAUDIA

PROFESORES

DR. FRANCISCO SÁNCHEZ LÓPEZ

M. EN C. MARIO JOSUÉ AGUILAR

SILAO DE LA VICTORIA, GTO.

15 DE SEPTIEMBRE DEL 2015
 Resultados

Obtención de peso molecular mediante la utilización del marcador comercial.

Mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa se extrajo el material genético de

Escherichia coli. En el gel se depositaron varias muestras de los diferentes equipos, junto
con un marcador de peso molecular los cuales se muestran en la siguiente figura.

Banda 1

Banda 2

Marcador de peso
ADN de E. Coli Equipo #2
molecular

Figura 1. Visualización en rayos UV del marcador comercial y muestra después de electroforesis en gel de agarosa.
La primera columna

Se utilizo un marcador de peso molecular en este caso HyperLadder™ 1kb, y se

graficaron el número de pb contra la distancia en píxeles de cada banda como se muestra
en la figura 3.

Figura 2. Tamaño en pares de bases del marcador de peso molecular con respecto la distancia en
píxeles.
Como se muestra en la figura 1 en la columna perteneciente a la muestra del equipo 2 se
visualizan 2 diferentes bandas, la banda 1 recorrió una distancia de 78 píxeles y la banda
2 recorrió una distancia de 351 píxeles, utilizando el modelo de la grafica anterior se
obtiene un tamaño de 10.25x103pb y de 130pb respectivamente.

Ya que el peso molecular de un nucleótido es de 330g/mol el peso correspondiente para

la banda 1 es de 6.77x106 g/mol y de la banda 2 es de 8.6x104 g/mol.

Obtención de la concentración mediante análisis densitométrico.

Para este cálculo se utilizó el software llamado ImageJ. El cual analiza un área delimitada
de una imagen y automáticamente arroja una grafica de la cantidad de luz en píxeles que
se encuentran a lo largo de la selección, también cuenta con diferentes tipos de
herramientas una de las cuales sirve para calcular el área que se desee delimitar de
dichas graficas en píxeles.

Primero se delimito el área de la imagen que contenía las bandas del marcador comercial,
las cuales arrojaron las curvas que se muestran en la figura 4. A pesar de que el
marcador cuenta con 14 bandas, se calculó el área de 7, debido a que eran las curvas
mejor definidas.

Figura 4. Gráfica de cantidad de luz en píxeles a lo largo del

marcador molecular.

Luego se realizo el mismo procedimiento para la muestra arrojando la gráfica que se

muestra a continuación.

Figura 5. Gráfica de cantidad de luz en píxeles a lo largo

de la muestra.
Una vez obtenidas las áreas bajo la curva de las 7 bandas seleccionadas del marcador se
graficaron con su correspondiente concentración como se muestra en la siguiente figura.

Figura 5. Datos obtenidos mediante el análisis densitométrico.

Se obtuvo el modelo mediante regresión lineal, sustituyendo en el modelo los valores de

las bandas de la muestra se obtiene que la concentración en la banda 1 es de
24.65ng/banda y para la banda 2 se obtiene una concentración de 952.47 ng/banda. EN
La práctica se depositaron 4μl de muestra teniendo así una concentración por banda de
6.16ng/μl para la banda 1 y 238.11 para la banda 2.

Obtención de concentración mediante métodos espectrofotométricos.

Un segundo método para la estimación de los ácidos nucleicos es midiendo su densidad

óptica (OD) por espectrofotometría usando el Thermo Scientific NanoDrop 2000, el cual
mostraba la concentración, la absorbancia a una determinada longitud de onda y el
cociente (260/280,260/230).

Fuente del ADN Bacteriano Fresa

Concentración (ng/µL) 1054.8 661.2

A260(10 mm) 21.095 13.224

A280(10mm) 13.535 11.848

260/280 1.56 1.12

260/230 1.80 0.42

Figura 6. Resultados obtenidos por análisis espectofotometrico para muestra de ADN de E. coli y de fresa.
Discusión

En la primera práctica se inoculó Escherichia coli en medio LB estéril. Posteriormente se

incubo aproximadamente por 24 horas permitiendo así que la bacteria entrase en fase
estacionaria.

Para la primera extracción de ADN se decanto el sobrenadante y se resuspendió la

pastilla microbiana en buffer TE (Tris-HCl; EDTA), posteriormente se agrego SDS al 10% y
proteínasa K todos estos componentes inhiben la acción y desnaturalizan las enzimas
nucleasas. (Zabala, 2005; Pingound, 2010). Con la utilización de estos componentes se
pretendió degradar aquellos compuestos que no son de interés.

EL SDS además de las funciones ya descritas permite romper la membrana celular y

nuclear y liberar el ácido nucleico, y la proteinasa K libera el ADN de las histonas donde
se encuentran proteínas que lo mantienen empaquetado.

Durante la etapa de extracción y purificación se mantuvo las muestras a una baja

temperatura lo cual resulto apropiado ya que es una variable importante para mantener
integro el ADN aislado (Salazar).

Cabe mencionar que durante el proceso de extracción y separación de ADN involucro

agitación mecánica, que ayudo a la separación de las dos cadenas de ADN ya que se
genera un flujo hidrodinámico. Además que la molécula de E. coli es larga y se requiere
una fuerza débil para ocasionar su ruptura.(Salazar,)

En el siguiente paso se agrego CTAB para remover escombros celulares, polisacáridos y

proteínas no hidrolizadas las cuales en la etapa de separación de fases por mezcla de
solventes fueron precipitados y se encuentran en la fase orgánica (Pingound, 2010).

Según Philips (2005) el ADN tiene carga negativa otorgada por sus grupos
fosfato.(Salazar, 2007). Aprovechando esta propiedad se agrego una mezcla polar de
solventes orgánicos compuesta por fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1).y así
separar los componentes de interés en este caso ácidos nucleicos en la fase acuosa.

Esta fase se transfirió a un tubo nuevo donde se adiciono Isopropanol que precipita los
ácidos nucleicos ya que son insolubles en soluciones alcohólicas (Philips, 1995; Salazar,
2007). Inmediatamente después se observo la formación de las hebrillas de ADN.
En la parte final de la extracción se centrifugó el tubo a 10000rpm y la pastilla obtenida se
dejo secar para luego volver a resuspenderla en buffer TE.

Una vez terminada la extracción se procedió a la cuantificación y visualización del ADN en

gel de agarosa.

La concentración estimada con el marcador y su modelo nos dice que la primera banda
tiene un tamaño de 10.25 Kb, y la segunda un tamaño de 130 pb. Debido a que el
marcador posee un rango de tamaño de 10037 a 200 pb y que de acuerdo con
Krebs,(2014) el tamaño del genoma de E. coli es de 4.6 Mb a 5.5 Mb el tamaño de ADN
obtenido es solo una estimación de lo que puede estar presente en la muestra.
Para este tipo de extracciones donde se quiere extraer ADN de alto peso molecular
Pingoud (2010) sugiere utilizar concentración de agarosa de hasta 0.3% a 2% ya que así
se logra una mayor movilidad electroforética sin embrago hay mayor rango de separación
entre las bandas (Salazar, 2007). La concentración de agarosa con la que se trabajo fue
1% permitiendo así migración efectiva únicamente a los fragmentos de ADN de bajo peso
molecular no obstante los tamaños de pares de bases reportados para ADN genómico de
E. coli son muy superiores al rango de tamaño que se puede obtener por una
electroforesis en gel de agarosa.(Salazar, 2007).

Otro de los factores de gran importancia es la elaboración del gel de resolución, ya que de
este depende la transmisión de la corriente eléctrica, y además mantiene el pH sin
variaciones mientras se hace la corrida electroforética. La elaboración en esta práctica del
gel fue realizada por otro equipo por lo cual no se desconoce si los resultados obtenidos
fueron alterados por esta preparación.

El análisis en el NanoDrop permitió estimar la concentración de ácidos nucleicos en

solución. A una longitud de onda de 260 nm se obtuvo una concentración de 1054.8 ng/μl
y 661.2 ng/μl para bacteria y fresa respectivamente.

Salazar menciona que para medir el nivel de contaminación por proteínas el cociente
260/280 se considera optimo cuando esta entre 1.8-2.0. De acuerdo con los resultados
existe presencia de proteínas ya que el cociente es de 1.56 y 1.12 para la muestra ADN
de E. coli y de fresa respectivamente.

Además el cociente 260/230 nos sirve para la determinación de contaminación por

fenolatos, compuestos aromáticos, tiocianatos, péptidos u otros compuestos. Una muestra
pura se espera un rango de 2-2.2. Para las muestras de ADN de E. coli y fresa los
cocientes fueron de 1.8 y 0.42 respectivamente, uno de los contaminantes en ambas
muestras posiblemente sea el EDTA ya que ambas muestras en la metodología ocupan
resuspender en buffer TE el cual contiene EDTA.(Salazar).

Para el análisis densitométrico una de las variables a considerar es el tiempo de corrida

electroforética, ya que la bibliografía indica un tiempo alrededor de 60 y 40 minutos, dejar
correr el gel el tiempo necesario ayuda a tener una mejor resolución de las bandas. Entre
mejor resolución tenga la banda el programa podrá determinar mejor la cantidad de luz.

Conclusiones
 El marcado de peso molecular utilizado en la práctica resulto ser inadecuado para
la estimación del ADN genómico de E. coli, no obstante este marcador permite
estimar fragmentos pequeños de ácidos nucleicos.
 La concentración de 1% de agarosa no es la apropiada si se desea la visualización
de fragmentos de ADN de gran tamaño como los requeridos para fragmentos de
ADN genómico de E. coli.
 La técnica no menciona la utilización de RNAsas lo cual hubiera asegurado la
ausencia de ARN y la estimación de la concentración de ácidos nucleicos se deba
únicamente por los fragmentos de ADN
 Teniendo en cuenta que el ADN genómico de E. coli es aproximadamente de 4.6Mb-5.5Mb
se debió disminuir a 25V o 75V y el tiempo de electroforesis aumentarse para conseguir la
mejor resolución posible.
Cuestionario 1
1.- Mencione la función de cada uno de los compuestos que se utilizan durante la
práctica

1. El buffer TE (Tris-HCl; EDTA) se utiliza en la resuspención de la pastilla bacteriana debido

a que el EDTA inhibe la acción de nucleasas.
2. El SDS (dodecil sulfato sódico) no solo se utiliza para desplazar las estructuras lipídicas de
las proteínas si no que también las despliegan (lisa la bacteria).
3. La proteinasa K es una enzima que rompe las proteínas que posterior mente se extraen
con disolventes orgánicos.
4. El NaCl crea un medio isotónico que estabiliza los ácidos nucleicos libres.
5. El CTAB además de solubilizar la membrana celular forma un complejo con el ADN
permitiendo su precipitación.
6. La solución fenol/cloroformo/alcohol isoamílico se utiliza para mantener separadas las
fases después de la centrifugación además que evita la aparición de espuma tras la
agitación.
7. El isopropanol sirve para precipitar el ácidos nucleicos.

2.- Indique 5 protocolos de biología molecular que dependen de la extracción de

ADN, cite al menos un estudio que utilice cada protocolo.

1) Reacción en cadena de polimerasa (PCR): Analysis of relative gene expression data

using real-time quantitative PCR and the 2− ΔΔCT method
2) Clonación de un fragmento de DNA: Aislamiento de clones con actividad endo-B-1, 4-
glucanasa a partir de un segmento de ADN de 13Kb de Clostridium sp IBUN22A.
3) Pruebas de paternidad: Aplicación de las técnicas de polimorfismo de DNA en la
resolución de casos de abigeato, identificación individual y determinación de paternidad
4) Detección de enfermedades: Extracción de ADN de Trypanosoma cruzi mediante
tratamiento con bromuro de hexadecil-trimetil-amonio.
5) Identificación de cadáveres: Revelado de manchas latentes: efectividad del luminol y
evaluación de su efecto sobre el estudio del DNA

3.- Redacte un protocolo de extracción de ADN con base en el método mostrado en

el video. (Sugiera cantidades y tiempos para cada paso):

Lisis celular
1) Congelar 24 horas 100gr de fresas dentro de una bolsa de plástico para crear los cristales
dentro de las células.
2) Dejar descongelar las fresas a temperatura ambiente.
Extracción de DNA
3) Una vez descongeladas las fresas, añadirle 50ml de jugo de piña a temperatura ambiente.
4) Moler hasta obtener una mezcla homogenizada
5) Filtrar el contenido de la bolsa depositando el jugo en un vaso de de vidrio previamente
desinfectado
6) Agregar 50 ml de Bacardi y dejar reposar hasta observar precipitación en la fase acuosa.
7) Transferir la fase acuosa a un recipiente de vidrio.
8) Dejar en el refrigerador durante 2 horas y repetir el paso 5 y 6.

Cuestionario 2
1.) ¿De qué manera cuantificarías el ADN en caso de no contar con
espectrofotómetro?
Se puede utilizar la técnica de Fluorometría la cual es más sensible y menos
susceptible a interferencias de proteínas y contaminantes que estén presentes en
la muestra. El fundamento de esta técnica es la unión especifica de colorantes
fluorescentes al ácido nucleico que absorbe la luz a una longitud de onda
determinada y emite luz de una longitud de onda superior es decir una de menor
energía. De esta manera se hace una relación entre la concentración de ácido
nucleico y la intensidad de emisión fluorescente. También esta técnica necesita de
estándares de concentración conocida, para poder interpolar y así encontrar una
concentración desconocida.
Uno colorante empleado es el Hoechst 33258 una bis-benzimida que se intercala
en la doble cadena de ADN en regiones ricas de AT que se emite en el espectro a
35 0nm y se emite en el visible a 450 nm.

2.) Menciona otra tinción que podrías utilizar de DNA en geles de agarosa
Se puede utilizar el SYBR®Safe, el cual se une de manera no covalente a los
ácidos nucleicos. Tiene una fluorescencia a 280 nm, una excitación máxima a 502
nm y una emisión máxima a 530 nm. El ADN puede visualizarse con una luz
ultravioleta en el rango de 470 a 530 nm.

BIBLIOGRAFIA

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Ediciones De La Universidad Autonoma De Yucatan.
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Madrid- España: Medica Panamericana
3) Gloria Morcillo, Estrella Cortés, josé García. (2013). Biotecnología y Alimentos. Madrid, España:
UNED
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Mazarrón, Murcia. Murcia- Roma: (Editrial no disponible)
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8) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:10 AM:
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9) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:15 AM:
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10) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:18 AM:
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11) Recuperado el 13 de septiembre de 2015 a las 11:25 AM:
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