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Nombre de la Materia: Gentica.

Nmero de la Prctica: 6 Nmero de la Sesin: 1 Mximo de integrantes: 20



Concentracin y pureza de ADN.

Introduccin:
La estimacin de la pureza de una muestra de cidos nuclicos se lleva a cabo por
un procedimiento que comnmente se le conoce como el cociente de absorbancias
A260/A280. Aunque este procedimiento primero se describi como un medio para estimar
la pureza de las protenas en presencia de cidos nuclicos, actualmente se utiliza para
estimar la pureza de los cidos nuclicos. La prueba se basa en la Ley de Beer-Lambert:
OD = Cb
en donde la densidad ptica (OD) es el producto del coeficiente de extincin (), la
concentracin de la muestra (C) y la ruta ptica (b). Con una ruta ptica de 1 cm, la cual es
comnmente utilizada en los espectrofotmetros, la ruta se puede ignorar y los coeficientes
de extincin se pueden explicar como un valor de absorbancia a una concentracin
especfica, como se denota en la siguiente ecuacin:
= OD/C
El coeficiente de extincin promedio comnmente aceptado para una solucin de
DNA de 1 mg/ml a 260 nm y 280 nm es de 20 y 10, respectivamente. Como una
equivalencia podemos decir que a 260 nm una solucin de DNA de 50 g/ml tendr un
coeficiente de extincin de 1.0. Similarmente, para protenas los valores de extincin a 260
nm y 280 nm para una concentracin de 1 mg/ml son de 0.57 y 1.00, respectivamente. As,
en trminos relativos, las muestras de cidos nuclicos se espera que tengan una mayor
absorbancia a 260 nm que a 280 nm, mientras que una muestra de protena se espera lo
contrario. Utilizando estos coeficientes de extincin, una muestra de ADN puro se espera
que tenga un cociente A
260
/A
280
de 2.0 (tpicamente se considera aceptable un rango entre
1.8 y 2.0), mientras que para protenas sea 0.57. Es importante notar que el cociente
A
260
/A
280
es slo un indicador de la pureza y no una medida precisa.
Las estimaciones de la pureza y concentracin se realizan en espectrofotmetros de
luz ultraviolea. Los equipos ms modernos tienen la capacidad de medir automticamente
las absorbancias a 260 y 280 nm y realizar el clculo del cociente y la estimacin de la
concentracin. Los espectrofotmetros estndar utilizan celdas de cuarzo que requieren un
volumen de muestra de 60-70 l, lo cual resulta en gran prdida de extracto de ADN. Sin
embargo, los espectrofotmetros de ltima generacin pueden realizar todos los clculos a
partir de volmenes tan pequeos como de 1 a 2 l y sin el uso de celdas de cuarzo. En esta
sesin de laboratorio utilizaremos el espectrofotmetro NanoDrop 1000 (fig. 1), que es un
modelo de ltima generacin.


Figura 1. Espectrofotmetro NanoDrop 1000.


Objetivo(s):
El alumno medir la concentracin y pureza del ADN extrado en la prctica
anterior.

MATERIAL
Cantidad Descripcin
2 Punta estriles para pipeta de 20 l.
1 Pipeta eppendorf (o equivalente) de 2 - 20 l.
1 Gradilla para tubos eppendorf.

REACTIVOS
Cantidad Nombre
1 vial Agua ultrapura.
2 l Extracto de ADN

EQUIPO
Cantidad Nombre
1 Espectrofotmetro NanoDrop 1000 conectado a computadora.
1 Mini centrfuga de 6 plazas para tubos eppendorf de 1.5 ml.


PROCEDIMIENTO
Descongelar los extractos de ADN y utilizar la micro centrfuga de seis plazas para
bajar las gotas de las paredes de los tubos. Calibrar el espectrofotmetro Nanodrop 1000
con 2 l de agua y proceder a tomar las lecturas de las muestras utilizando volmenes de 2
l. La muestra es colocada en la base del lector como se muestra en la figura 2. Se procede
a bajar el brazo con sumo cuidado (fig 3). Al dar click en Measure el brazo baja
automticamente (fig. 4) para incrementar el dimetro de la gota que por tensin superficial
se mantiene en contacto con las dos terminales pticas. Registre las lecturas del cociente
A260/A280 y la concentracin de ADN en ng/l del cuadro que aparece en el monitor (fig.
5). Es importante limpiar las terminales pticas despus de cada lectura.











Figura 2. Colocacin de 2 l de
extracto de ADN en la base del lector.







Figura 3. Brazo lector en contacto con
la muestra.







Figura 4. Al realizar la lectura en
brazo baja automticamente.


Figura 5. Cuadro de control y lectura del NanoDrop 1000.


Cuestionario:
1. Qu significa un cociente 260/280 de 1.2?
2. A cuantos g/ml equivalen 25 ng/l?
3. Cul es una de las desventajas de los espectrofotmetros convencionales que
utilizan celdas de cuarzo?

Literatura: NanoDrop 1000 Spectrophotometer V3.7 Users Manual.
http://www.nanodrop.com/library/nd-1000-v3.7-users-manual-8.5x11.pdf

Bibliografa de Apoyo:
Karp, A., P.G. Isaac y D.S. Ingram. 1998. Molecular Tools for Screening Biodiversity.
Kluwer Academic Publishers. Dordrecht.
Darbre, P.D. 1988. Introduction to Practical Molecular Biology. Wiley. Chichester.