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8/01/08

Título de la práctica:
Determinación cuantitativa del hierro

Fundamento de la práctica:
En primer lugar, el hierro ferrico presente
en la muestra y unido a la transferrina es
liberado por la acción de guanidinio.
Seguidamente, el hierro ferrico libre es
reducido a ferroso por la
hidroxilamina.
Posteriormente, el hierro ferroso
reacciona con la ferrozina para producir
un complejo coloreado. Finalmente, la
intensidad de formación del complejo
coloreado es medida
espectrofotometricamente.

Material:
• tubos de plástico de un solo uso.
• Un rotulador de vidrio.
• 2 pipetas graduadas de 1 ml.
• 1 pipeta automática capaz de dispensar
200 µl.
• Puntas de pipeta automática.
• 3 cubetas de espectrofotometría.
• Un espectrofotómetro.
• Reactivos

R1 Citrato pH 2,2 50 mmol/L


Tampon
R2 Acido ascorbico 113,5 mmol/L
Reductor _
R3 TPTZ 9,6 mmol/L
Color
IRON CAL Patrón primario acuoso de Hierro 100 μg/dL
__
Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Reductor en un
frasco de R 1 Tampón.
Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad del reactivo
de trabajo: 1 mes en nevera (2-8 °C). R3: Listo para su uso.

Procedimiento:

1
Es una técnica que se desarrolla en dos pasos

Blanco Patron Muestra


RT (mL) 1,0 1,0 1,0
Patrón (μl) -- 250 -
Muestra (μl) - -- 250

1. Se vierte en la cubeta un poco de agua


destilada y se mide su absorbancia
2. Se prepara la muestra patrón y se mide su
absorbancia
3. Se prepara y se mide la absorbancia de la muestra problema
4. Se añade una gota de R3 (TPTZ) a cada tubo, se mide su absorbancia de cada
uno.

Longitud de onda: ..........595 nm (550-600)


Cubeta:...............................1 cm paso de luz
Temperatura .....................37°C / 30°C / 25°C Ajustar el espectrofotómetro a cero
frente a agua destilada. Pipetear en una cubeta.
Resultados:

Absorvancias medidas:
Blanco Patron Muestra
1º Medicion 0,000 0.515 0.477
2º con TPTZ 0,000 0.021 0.105

(A2- A1) Muestra X 100 (conc. patrón) = μg/dl de Fe en muestra


(A2- A1) Patrón

(0,477- 0,105) Muestra X 100 (conc. patrón) = 83,3 μg/dl de Fe en muestra


(0,515- 0,021) Patrón

Interpretación de los resultados:

VALORES DE REFERENCIA
Hombres: 65 - 145 μg/dL (11,6- 31,3 μmol/L)
Mujeres: 40 - 150 μg/dL (7,16 - 26,85 μmol/L).
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus
propios valores de referencia.

El resultado obtenido ha sido 83,3 μg/dl de Fe en muestra, este resultado se


encuentra dentro de los valores normales

17/01/08

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Título de la práctica:
Fórmula leucocitaria

Fundamento de la práctica:
La formula leucocitaria o recuento diferencial leucocitario (RDL) consiste en la
determinación del porcentaje que representa cada uno de los tipos de leucocitos con
respecto al total de ellos.

Material:

• Microscopio.
• Papel y lápiz o un registrador
automático de células. Este último
consiste en un aparato que tiene unas
teclas. Cada tecla representa a un tipo
de leucocito y hace una anotación cada
vez que es presionada. Cuando el
número de anotaciones llega a 100,
suena una alarma.
• Aceite de inmersión
• Extensión de sangre teñida
• Papel de óptica

Procedimiento:
1. Preparar el microscopio para que tenga el condensador alto y el
diafragma abierto.
2. Enfocar la preparación con el objetivo de 10 x.
3. Comprobar que la preparación es buena y elegir una zona en la que los
hematíes no estén superpuestos y los leucocitos se encuentren
uniformemente distribuidos.
4. Enfocar esa zona de la
preparación con el objetivo
de inmersión.
5. Observar esa zona de la
preparación mientras se
describe un recorrido en
forma de almenas o de
greca.

Resultados:
• Las células contadas pueden
anotarse mediante un registrador
automático de células; pero esto
también puede hacerse mediante
un lápiz y papel. Para ello se
dibujan unas columnas que
representen cada un tipo de
leucocito, y se traza una raya en la
columna correspondiente cada vez

3
que se ve un leucocito, o también se
puede utilizar el método que se ve en
la figura anterior.
• Cuanto mayor es el número de
leucocitos contados, mas exacta es la
determinación. Sin embargo, en la
practica solo se cuentan 100 leucocitos
o, como máximo, 200. Si se encuentra
un mayor numero de linfocitos que de
neutrófilos (en el adulto) o más de un
10% de eosinófilos o más de un 12%
de monocitos, el RDL se hace
contando 200 leucocitos y dividiendo,
posteriormente, el resultado obtenido
entre 2.

Interpretación de los resultados:


Hay que tener en cuenta que hasta los 4 años de vida se observa una inversión de
la formula leucocitaria, es decir, normalmente se encuentran en sangre periférica más
linfocitos que neutrófilos. Las alteraciones cuantitativas de los leucocitos se reseñan en
la siguiente tabla:
VALORES obtenidos VALORES NORMALES VALORES ALTOS VALORES BAJOS
NEUTROFILOS 3 3 Neutrofilia Neutropenia
2.000-8.000/mm 2.000-8.000/mm
SEGMENTADOS 46 45-75
NEUTROFILOS Desviacion a la Desviacion a la
EN CAYADO 6 0-9 % izquierda derecha
EOSINOFILOS 3 3
0-800/mm 0-800/mm
5 0-5 % Eosinofilia Eosinopenia
3 3
BASOFILOS 0-200/mm 0-200/mm
1 1-2 % Basofilia Basopenia
MONOCITOS 3 3
160-1.000/mm 160-1.000/mm
4 3-8% Monocitosis Monocitopenia

LINFOCITOS 1.000-5.000/mm
3
1.000-5.000/mm
3
Linfocitosis Linfopenia
34% 20-44 %

En esta
imagen se expresa el lugar y la forma de hacer el recuento diferencial

4
i6nica.
17/01/08
Finalmente, la hemoglobina A2 se
cuantifica mediante lectura
espectrofotométrica a 415 nm.

Material:
• Tubos de
recogida de sangre que contengan heparina o EDTA como
anticoagulante.
• Pipetas Pasteur.
• Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml.
• Una prepipeta o pera de aspiración.
• Micropipetas automáticas capaces de dispensar 50, 100 y
200 µl.
• Puntas de micropipeta (amarillas).
• Un rotulador de vidrio.
• Tubos de ensayo.
• Una gradilla.
• Un espectrofotómetro ajustable a 415 nm.
• Cubetas de espectrofotómetro.
• Papel y un bolígrafo.
• Agua destilada o desionizada.
• Reactivo, tampón biológico 15mol/l, detergente 0,1 g/l, pH 7,6
• Microcolumnas Contienen una resina de intercambio aniónico
equilibrada. En ella quedan retenidas las hemoglobinas.

Procedimiento:
1. A partir de la sangre problema se ha de preparar un hemolizado que
contenga la Hb libre en solución. Este hemolizado se prepara de la
siguiente forma:
a) Pipetear en un tubo de ensayo 50 µl de sangre y 200 µl de
reactivo.
b) Agitar bien.
Este hemolizado se utilizara en la separación y lectura de la Hb A2.
2. A partir del hemolizado anterior se debe preparar una dilución que
contenga la Hb a una concentración menor. Esta dilución del
hemolizado se prepara de la siguiente manera:
a) Pipetear en un tubo de ensayo 50 μ1 de hemolizado y 12 ml de
agua destilada.
b) Agitar bien.
Esta dilución del hemolizado se empleará en la lectura de la Hb total.
(Paso 9)
3. Destapar la parte superior de la microcolumna, romper a continuación
la lengüeta inferior y bajar el disco superior hasta el nivel de la resina,
evitando comprimirla, con la ayuda del extremo piano de una pipeta.

5
4. Dejar gotear hasta que el líquido
alcance el nivel del disco,
desechando el eluído.
5. Aplicar cuidadosamente sobre el
disco superior 50 μ1 de
hemolizado y se desecha el
eluído.
6. Cuando haya penetrado todo el
hemolizado añadir, procurando
arrastrar los posibles restos del
mismo, 200 µl de reactivo y se
desecha el eluído.
7. Colocar la microcolumna sobre
un tubo de ensayo y añadir: 3,0 ml de reactivo y se recoge el eluído
(fracción de HbA2)
8. Agitar bien y leer la absorbancia de la fracción Hb A2 a 415 nm. frente
a agua destilada (AHbA2).
9. Agitar bien la dilución del hemolizado, preparada previamente y que
contiene toda la Hb.
10. Leer a 415 nm. y frente a agua destilada, la absorbancia de la Hb total
(AHbT).

Resultados:

Tubos Absorbancia
Blanco 0,000
HbA2 0,079
Hbt 0,683
V HbA2 = 3 ml.
V Hbt = 12 ml.
Una vez efectuadas las medidas de absorbancia, se calcula el porcentaje
que representa, en la muestra, la HbA2 con respecto al resto de las
hemoglobinas. Para ello, se utiliza la siguiente formula:

AHbA2 x VHbA2 x 100= % HbA2


AHbt x VHbt
0,079 X 3 x 100= 2,89 % HbA2
0,683 X 12
Interpretación de los resultados:
Los valores normales de Hb A2 en la sangre periférica están
comprendidos, entre el 1,3% y el 3,7% del total de la hemoglobina presente en
aquella.
Un aumento del porcentaje normal de la HbA2 detectada en la sangre,
que oscila entre el 4 y el 10%, suele darse en la β-talasemia.
Cuando se encuentra un porcentaje de Hb A2 sanguínea superior al
10%, es probable que ello se deba a la existencia en la sangre de hemoglobinas
anómalas (Hb E, Hb C, Hb Koln, etc.) que tienen un punto Isoelectrico* (pl)
similar al de la Hb A2 y que, debido a ello, son eluídas junto con esta, por lo

6
que falsean la determinación.
Los resultados obtenidos se
encuentran dentro de los
valores normales por lo
tanto no hay una β-
talasemia.
La β-talasemia es una
hemoglobinopatia
hereditaria caracterizada por
una producción disminuida
de cadenas globínicas β.
Estas cadenas forman parte
de la estructura de la
hemoglobina A).
En el rasgo β-talasémico la
concentración de
hemoglobina A2 en sangre
se encuentra elevada ya que
se produce un aumento de la
síntesis de hemoglobinas no
constituidas por cadenas β.
En el diagnóstico del rasgo β-talasémico, deben tenerse en cuenta tanto
los niveles de hemoglobina A2 como el historial familiar y los datos de
laboratorio, incluyendo el hierro en suero y la capacidad de fijación del hierro,
la morfología de los hematíes, la hemoglobina, el hematocrito y el volumen
corpuscular medio.
El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado
de un` único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.

17/01/08

Título de la práctica:
Determinación del grupo sanguíneo en porta

Fundamento de la práctica:
Consiste en observar la aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie
de antisueros conocidos y de reconocida eficacia, para determinar el grupo
ABO del individuo.

Material:
• 2 portaobjetos o tarjeta visualizadora
de fondo blanco.
• Un rotulador de vidrio.
• Una pipeta pasteur desechable.

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• Palillos mezcladores.
• reloj.
• Suero anti-A.
• Suero anti-B.
• Suero anti- AB
• Sangre capilar o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.

Procedimiento:

1. Coger dos portaobjetos. Marcar una con la letra A, otra con letra B y
otra con las letras A y B
2. Depositar una gota de suero anti-A (azul) en la sección A del
portaobjetos, una gota del suero anti-B (amarillo) en la sección B, y otra
gota de anti-AB (transparente) eN la sección AB.
3. Situar una pequeña gota de sangre (aproximadamente la mitad del
volumen usado de
antisuero) junto a la
gota de antisuero.
4. Mezclar ambas gotas
en cada sección
utilizando un palillo
distinto en cada una
de ellas y formando
un circulo de 2 a 2,5
cm de diametro.
5. Hacer oscilar
suavemente el
portaobjetos hacia
delante y hacia
detrás, durante dos
minutos.
6. Observar la
presencia o ausencia
de aglutinación.
Lectura de resultados:

Hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un liqui-
do claro. En el caso contrario, los hematíes permanecen en forma de suspen-
sión homogénea de color rojizo.
La presencia o ausencia de aglutinación puede confirmarse mediante examen
microscópico de las mezclas.
En general estas pruebas son muy eficaces ya que la presencia de plasma en la
muestra aumenta la velocidad de la reacción y el tamaño de los grumos. El
resultado puede observarse en unos segundos, aunque conviene reexaminar la
reacción del anti-A al cabo de 2 minutos para comprobar que no se ha pasado por alto
ninguna reaccion debil. Estas suelen ocurrir en menos de un 1 % de las muestras analizadas.

Interpretación de los resultados:

El grupo eritrocitario que se le asignara, atendiendo a los resultados obtenidos, se

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puede ver en el cuadro siguiente:

Hematíes y suero anti-A Hematíes y suero anti-B Grupo eritrocitario


+ - A
- + B
+ + AB
0
+ = presencia de aglutinacion - = ausencia
de aglutinacion

En el caso de que el grupo obtenido sea


el A, los hematíes problema deberán ser
ensayados de nuevo con lectina anti-A1; de forma
que si se produce aglutinación, el sujeto
pertenecerá al subgrupo A1.

17/01/08

Título de la práctica:
Determinación celular en
tubo

Fundamento
Los hematíes problema contienen
las sustancias antigénicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que
poseen anticuerpos frente a esos antígenos. El resultado final es la presencia o no de
aglutinación en los hematíes reaccionantes.

Materiales:

• Tubos de centrifuga
• Rotulador de vidrio

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• Pipetas Pasteur
• Centrifuga
• Gradillas
• Suero anti-A
• Suero anti-B
• Suero anti-AB
• Solucion salina fisiologica.
• Sangre total anticoagulada. Para esta técnica es preferible usar una suspensión de
los hematíes problema.

Procedimiento:

1. En primer lugar realizamos el lavado de los hematíes problema. Para ello


rotulamos convenientemente un tubo de centrifuga
y añadimos 1 ml de la muestra de sangre.
Completamos el tubo con solución salina y
agitamos para suspender los hematíes.
Centrifugamos 4 minutos a 2000 r.p.m. y
decantamos el sobrenadante.
2. A los hematíes del tubo les añadimos una cantidad
suficiente de solución salina como para obtener una
suspensión al 2%. Esto es aproximado, aunque
debemos establecer los limites entre el 2 y el 4%
3. Rotular tres tubos de ensayo bien limpios con las
letras A, B y AB.
4. Añadir a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes al 2%.
5. Añadir dos gotas de suero anti-A en el tubo A, dos gotas de anti-B en el tubo B,
y dos gotas de anti-AB en el tubo AB.
6. Centrifugamos todos los tubos durante 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 30 segundos a
3.400 r.p.m (centrifuga de inmunohematologia).

Lectura de resultados

Después de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para


desprender el sedimento y observar macroscópicamente la presencia o ausencia de
aglutinación.
Reacción negativa: Los hematíes se resuspenden homogeneamente.
Reacción positiva: Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez
desprendido el sedimento.

Interpretación clínica:

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Se realiza igual que en la
técnica en porta.
Es importante destacar que
los restos de detergente o
sustancias extrañas en los
tubos pueden ocasionar falsos
negativos.
También pueden darse falsos
positivos, principalmente por
dos motivos:
• Aglutinación no
especifica: Se debe a
la presencia de acido
hialuronico en la
sangre, procedente de
la gelatina de Wharton
del cordón umbilical,
y se elimina añadiendo
una gota de
hialuronidasa a la
suspensión de
hematíes.
• Fenomeno de
Rouleaux: Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan
una imagen de pilas de monedas. Las sustancias que mas frecuentemente
originan este fenómeno son: el fibrinógeno, las gammaglobulinas, el dextrano y
la polivinilpirrolidona.
Estos fenómenos pueden evitarse con el lavado previo de los hematíes problema.

17/01/08

Título de la práctica:
Determinación del grupo Rh en porta

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Fundamento
La técnica está basada en la detección del antígeno D sobre la superficie de
los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que
contiene anticuerpos anti-D.
En el caso de que los hematíes contengan el antígeno D se producirá una tinación
que puede observarse a simple vista.

Material:
• Portaobjetos
• Pipetas Pasteur. Rotulador de vidrio.
• Palillos agitadores.
• Suero anti-D.
• Sangre total anticoagulada.

Procedimiento
1. Depositar una gota de
suero anti-D sobre el
porta
2. Situar una pequeña
gota de sangre
(aproximadamente la
mitad del volumen
usado de antisuero)
junto a la gota de
antisuero.
3. Mezclar ambas gotas
utilizando un palillo
distinto en cada una de
ellas y formando un
círculo de 2 a 2,5 cm de
diametro.
4. Hacer oscilar
suavemente el
portaobjetos hacia
delante y hacia
detrás, durante dos
minutos.
5. Observar la presencia o ausencia de aglutinación.
Lectura de resultados:
Esperamos dos minutos antes de dar el resultado de la prueba.
Aglutinación positiva: Aparición de grumos rojos sobre un fondo claro. No deben
confundirse con pequeños coágulos de fibrina presentes en la muestra.
Aglutinación negativa: La mezcla da lugar a una suspensión homogénea de los
hematíes.
La mezcla de sangre con albúmina bovina debe dar siempre aglutinación
negativa. En caso de no ser así, no podemos informar del resultado de la prueba.
Interpretación de los resultados

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Los resultados se interpretan según el siguiente cuadro:
Agutinación Interpretación
- n
Rh negativo
+ Rh positivo
+ = Aglutinación positiva - =
Aglutinación negativa

17/01/08

Título de la práctica:
Determinación del grupo Rh en tubo

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Fundamento:
Al igual que en la prueba en portaobjetos, intentamos poner de manifiesto la
presencia del antígeno D en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a
un suero anti-D.

Material necesario
•Tubos de centrífuga.
•Rotulador de vidrio.
•Gradilla.
•Pipetas Pasteur.
•Centrífuga.
•Suero anti-D.
•Albúmina bovina al 30%.
•Solución salina fisiológica (al 0,9%)
•Hematíes problema preparados en
suspensión al 5%.Antes de proceder a
suspender los hematíes debemos lavarlos
tres veces en solución salina fisiológica.
Para ello tomamos un volumen
aproximado de 0,5 ml de la sangre problema y la llevamos a un tubo de centrífuga.
Completamos el tubo con solución salina y agitamos suavemente para resuspender los
hematíes. Centrifugamos durante 4 minutos a 2.000 r.p.m. Posteriormente retiramos el
sobrenadante y repetimos el proceso dos veces más.
El sedimento hemático resultante se resuspende en la cantidad de solución salina
necesaria para obtener una suspensión al 5%.
Procedimiento:
1. Rotulamos dos tubos limpios con las letras D y A.
2. En el tubo D añadimos una gota de suero anti-D y el tubo A ponemos una gota
de albúmina bovina al 30%.
3. A cada tubo le añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5%. Agitamos
suavemente para mezclar el contenido de los tubos.
4. Centrifugamos durante 1 minuto a 1000 r.p.m. o 30 segundos a 3.500 r.p.m.

Lectura de resultados
Con el pulpejo de los dedos medio y anular golpeamos suavemente el fondo de los
tubos para despegar el botón hemático. Se considera aglutinación positiva si se forman
grumos de color rojo en un líquido claro.
Por el contrario, si se resuspenden homogéneamente los hematíes, decimos que la
aglutinación es negativa.

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El tubo con albúmina es un control negativo, y debe dar siempre ausencia de
aglutinación. En caso de no ser así.
El resultado de la prueba no es
válido.

Interpretación clínica de los


resultados:
Si el tubo D presenta aglutinación y
el tubo A no, decimos que el
paciente es Rh positivo.
Si no se produce aglutinación en
ninguno de los dos tubos
procedemos a incubar ambos a 37°
C durante media hora.
Posteriormente centrifugamos a 1.000 r.p.m. durante un minuto y observamos si existe o
no aglutinación.
En el caso de persistir la negatividad comprobaremos que el paciente no posee un DU (D
débil) mediante una prueba de Coombs indirecta.
Si después de todos estos pasos el resultado es la no aglutinación, informaremos que el
paciente es Rh negativo.

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24/01/08

Título de la práctica:
Determinación sérica del grupo ABO

Fundamento:
El suero de un individuo sólo debe contener anticuerpos frente a los antígenos
que no están presentes en sus propios hematíes. Por ello, al hacer reaccionar este suero
con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B, sólo producirá aglutinación en el
caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios
hematíes.
Esta técnica puede realizarse tanto en porta como en tubo, aunque se prefiere la
determinación en tubo porque la centrifugación de los hematíes intensifica el fenómeno
de aglutinación.

Material necesario
•Tubos de centrífuga.
•Pipetas Pasteur.
•Baño de agua.
•Centrífuga
•Reloj.
•Rotulador de vidrio.

•Gradilla.

•Hematíes del grupo A


•Hematíes del grupo B.

•Hematíes del grupo 0.


•Hematíes de la sangre problema
•Suero obtenido mediante coagulación
de la sangre en baño de agua a 37 °C
durante 20 a 30 minutos. Posteriormente
centrifugamos durante 10 minutos a
3.000 r.p.m. y extraemos el
sobrenadante con ayuda de una pipeta
Pasteur.

Procedimiento:
1. Para evitar falsos negativos por la presencia de complemento activo en el
suero, es aconsejable la inactivación previa de la muestra. Esto se realiza
manteniendo el suero en un baño de agua a 56 °C durante 10 minutos.
Con esto evitamos los fenómenos de hemólisis debidos al complemento.
2. Lavamos tres veces los hematíes propios de la sangre problema con
solución salina isotónica según la técnica descrita en la práctica XVIII.
Posteriormente preparamos una suspensión de estos hematíes al 5% en

16
solución salina.
3. Rotulamos un tubo de centrífuga con la letra A1, otro B, otro O y otro C.
4. Añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado.
5. Depositamos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponda
con la letra del tubo rotulado. En el tubo C añadimos una gota de la sus-
pensión de los hematíes propios de la sangre problema, ya que nos ser-
virá de control negativo.
6. Agitamos suavemente y centrifugamos a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto.

Lectura de resultados
Golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos para despegar el
sedimento hemático.
Si aparecen unos grumos rojos flotando en un líquido claro indica que
existe aglutinación. En el caso contrario, los hematíes se resuspenden
homogéneamente dando lugar a un líquido de color rojizo.

Interpretación clínica de los resultados:

El grupo eritrocitario que se asignará, atendiendo a los resultados obtenidos, se puede


ver en el siguiente cuadro, aunque nosotros solo utilizamos un tubo para el grupo A
genérico:
Tubo Al Tubo A2 Tubo B Tubo Tubo C Ac presentes Grupo
O
en el suero eritrocitario
- + - - Anti-B A1
- o +* - + - - Anti-B y anti-A1 " A2
+ + - - - Anti-A B
+ + + - - Anti-A y anti-B O
- - - - Ninguno AB
- o +" - - - - Ninguno o Anti- 1
A2 B
+ + A1
+ + + Autoanticuerpos Ininterpretable
+ = Aglutinación
- = No aglutinación
* = Este anti-Al se encuentra sólo en un 2% de los individios A2.
" = Este resultado se observa sólo en el 25% de los individuos A2B.
Es difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso de los recién
nacidos, ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados aún. También
encontramos dificultades en los pacientes con agammaglobulinemia, ya que
carecen de anticuerpos, y en aquellos que poseen otros anticuerpos específicos
o inespecíficos capaces de reaccionar con los antígenos del grupo ABO.

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Discrepancias entre la prueba celular y la sérica
En el caso de no obtener el mismo resultado en ambas pruebas debemos
proceder de la siguiente manera:
1. Repetir ambas pruebas.
2. En el caso de persistir la
discrepancia, se obtendrá
una nueva muestra de
sangre y se realizarán
ambas pruebas utilizando
hematíes lavados y resus-
pendidos correctamente a
la concentración óptima
de cada técnica.
3. Efectuar una prueba de
Coombs directo sobre los
hematíes para detectar posibles autoanticuerpos.
4. Realizar la prueba sérica utilizando un panel de screening con hematíes A1, A2,
B, O.
Causas de la discrepancia entre la prueba celular y sérica
Las causas más frecuentes obedecen a tres tipos distintos:
1. Errores técnicos:
•Identificación incorrecta de las
muestras o anotación de los resultados.
•No añadir todos los reactivos y
muestras correspondientes.
•Contaminación de los reactivos o
hematíes del panel de screening.
•Proporción inadecuada de muestra y
reactivos.
•Sobrecentrifugación o centrifugación insuficiente.
•No valorar la hemólisis considerándola como aglutinación negativa.
2. Problemas con la muestra:
•Presencia de autoanticuerpos.
•Antígenos A o B débiles, congénitos o adquiridos.
•Especificidad B adquirida en pacientes A1., por una infección bacteriana.
Inmunodeficiencias congénitas o adquiridas.

29/01/08

18
Título de la práctica:
Detección del carácter secretor de los antígenos del grupo sanguíneo ABH de la saliva

Fundamento de la práctica:
Esta práctica consiste en poner en contacto la saliva de la persona sometida a estudio
con sueros que contienen anticuerpos dirigidos específicamente contra los antígenos
del sistema ABH que se cree que pueden ser secretados. Seguidamente, se pone en
contacto la mezcla anterior con hematíes que presentan en su superficie el antigeno
estudiado. Por ejemplo, si una persona es del grupo A, se pone en contacto con su
saliva, en primer lugar con un suero anti-A y, posteriormente, con
hematíes del grupo A.
Una persona secretora tiene presentes en su saliva los antígenos del
sistema ABH que se encuentran en la superficie de sus hematíes.
Debido a ello, al poner en contacto su saliva con sueros que
contienen anticuerpos dirigidos específicamente contra estos
antígenos, no se verifica un bloqueo de estos últimos. Por
consiguiente, al añadir a la mezcla anterior, los hematíes
susceptibles de ser aglutinados, no se producirá una aglutinación de
los mismos. Por el contrario si la persona no es secretora, no tiene
presentes en su saliva los antígenos del sistema ABH que se encuentran
en la superficie de sus hematíes. Debido a ello, al poner en contacto su saliva
con sueros que contienen anticuerpos dirigidos específicamente contra estos antígenos,
no se verifica un bloqueo de estos últimos. Por consiguiente al añadir a la mezcla
anterior, los hematíes susceptibles de ser aglutinados se producirán una aglutinación
de estos últimos.
Como en esta prueba lo que indica positividad (posesión de carácter secretor) es la
ausencia de aglutinación y lo que indica negatividad (carencia de carácter secretor) es
la aparición de aglutinación se dice que es una técnica de inhibición de la
hemoaglutinación.

Material necesario:
• Tubos de ensayo apropiados para centrifugación
• Un rotulador de vidrio
• Pipetas Pasteur
• Un cronómetro
• Una centrífuga
• Un baño de agua
• Ractivos:
Suero fisiológico
Lectina anti-H
Suero anti-A
Suero anti-B
Hematíes de tipo A y B adecuadamente lavados y suspendidos al 3-5% en suero
fisiológico
Saliva de una persona no secretora, adecuadamente procesada

19
Muestra:
De 2 a 5 ml de saliva, recogida en un recipiente apropiado o, directamente, en un tubo
de ensayo. Esta saliva debe ser procesada de la
siguiente forma:
Calentar la saliva, poco tiempo después de su
recolección, durante 10 minutos, en un baño de agua
previamente ajustado a temperatura de ebullición.
Con esto se pretende la destrucción de las enzimas
salivares.
Centrifugar durante 5 minutos, a unas 3500 r.p.m.
Tras esto se ha de obtener un sobrenadante claro.
Recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo de
ensayo limpio, previamente rotulado con las siglas
"MS" (de muestra de saliva) y con la fecha de
procesamiento.
Conservar la muestra de saliva, convenientemente
procesada, a 2-8 grados, hasta el día de su análisis.
También puede congelarse la muestra, durante
períodos largos de tiempo.

Técnica:
1°- Rotular un tubo de ensayo con la letra C (de control) y otra con la letra T (de test)
2°- Situar, en ambos tubos, 1 gota de lectina o del antisuero capaz de reaccionar con el
antígeno que se pretende detectar (H,A o B). El antisuero o lectina a utilizar depende del
grupo ABO al que pertenece la persona investigada.
3°- Añadir una gota de la saliva procedente de una persona no secretora, en el tubo C, y
una gota de la muestra en el tubo T.
4°- Agitar el contenido de ambos tubos hasta obtener una buena mezcla de las
substancias
5°- Incubar ambos tubos, a temperatura ambiente (20-25 grados), durante 10 minutos
6°- Agregar a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes que presenta el antígeno
sometido a estudio
7°- Agitar el contenido de ambos tubos hasta obtener una buena mezcla de todas las
sustancias que contienen
8°- Incubar los dos tubos, a temperatura ambiente, durante 5 minutos
9°- Inmediatamente después, centrifugar el contenido de ambos tubos, a unas 3500
r.p.m., durante unos 20 segundos
10°- Mediante un suave golpeteo ejercido con los dedos resuspender el botón
sedimentario formado en el fondo de cada uno de los tubos

Lectura de los resultados:


Hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro. En
el caso contrario los hematíes se resuspenden homogéneamente, dando lugar a un
líquido de color rojizo.
En esta prueba, la presencia de aglutinación es considerada como un resultado negativo
y la ausencia de aglutinación indica un resultado positivo.
Un resultado negativo se produce en personas no secretoras y un resultado positivo en
personas secretoras

20
Si los aglutinados formados son débiles, una vigorosa agitación durante la resuspensión
del botón sedimentario, puede dispersarlos y dar lugar a una errónea lectura del
resultado.
Pueden aparecer falsos positivos o negativos a
consecuencia de una contaminación de los
reactivos, un inadecuado almacenamiento de los
mismos, una incorrecta incubación o
centrifugación, una omisión de alguno de los
reactivos y en determinados procesos
patológicos.
•Saliva A (Paula): no hay aglutinación por lo que
es una persona secretora.
•Saliva B (Fátima): se aprecia aglutinación tras
ejercer un suave golprteo por no que no es
secretora.

Interpretación de los resultados obtenidos:


El 80% de las personas de raza caucásica son secretoras.
La detección del carácter secretor de una persona puede tener interés en el ámbito de la
medicina legal. Así pues, por ejemplo, si se encuentra esperma en el lugar donde se ha
cometido un acto delictivo y se determina analíticamente el carácter no secretor del
individuo del que procede este líquido corporal, posteriormente, se puede descartar la
autoría del hecho criminal por parte de un sospechoso, en el caso de que, tras el estudio
de la saliva de éste, se establezca su carácter secretor.
En el 90% de la población, también se encuentra una gran cantidad de antígenos Lewis
(a o b), en la saliva. En el 10% restante de la población, no se encuentran antígenos
Lewis en la saliva.
Atendiendo a la presencia o ausencia en la saliva de antígenos de los sistemas ABH y
Lewis, se clasifica a los individuos en cuatro grupos distintos:
•Individuos secretores ABH y que también expresan antígenos del sistema Lewis.
Representan el 70% de la población.
•Individuos no secretores ABH, pero que expresan antígenos Lewis (principalmente el
a). Constituyen el 20% de la población.
•Individuos secretores ABH, pero que no expresan antígenos Lewis. Representan el 9%
de la población.
Individuos no secretores ABH y que tampoco expresan antígenos Lewis. Constituyen el
1% de la población.

21
20/02/08

Título de la práctica:
Recuento de reticulocitos

Fundamento de la práctica:
Podemos observar los reticulocitos al microscopio óptico mediante la tinción con
colorantes vitales, azul de metileno o azul de cresil brillante. Estos colorantes dan lugar
a la precipitación de los restos de ARN, y se observan como filamentos de color azul
intenso en el
interior de la célula.
Dado que el ARN
del reticulocito
desaparece a los
pocos días de entran
en la sangre, su
recuento servirá como medida del número de células que libera la médula ósea. Esto es,
el número de reticulocitos en sangre circulante es, probablemente el mejor y más
sencillo indicador de la eritropoyesis. Un aumento
puede interpretarse como indicación de una elevada
demanda de nuevos eritrocitos y un correcto
funcionamiento de la médula ósea. Por el contrario
cuando la demanda disminuye o la médula ósea falla
en sus funciones, la cifra de reticulocitos baja.
Según el grado de maduración que posea el
reticulocito presentará un modelo de reticulocito
distinto, de ovillo denso en el caso de los más
inmaduros o de gránulos escasos para los más
maduros. Se pueden clasificar en cuatros grupos
distintos.

Materiales utilizados:
•Microscopio óptico
•Aceite de inmersión
•Pipeta Pasteur
•Portas
•Muestra
Un tubo ya preparado el cual ya contiene los colorantes (azul de cresil brillante).
Y sangre anticoagulada con EDTA. (Debido a que los reticulocitos también maduran in
vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extraído recientemente, como
máximo 6 horas antes de su análisis).

Procedimiento:
1°- Añadir tres gotas de sangre a uno de los tubos ya preparados que contienen 100
microlitros de colorante estabilizado.
2°- Mezclar bien e incubar durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.
3°- Volver a mezclar la suspensión
4°- Con la pipeta Pasteur aspiramos lo suficiente para hacer por lo menos con la mezcla
un par de extensiones. (O más si sobra)
5°- Dejar secar al aire

22
6°- Una vez realizado todo esto se pasa a observar al microscopio con el objetivo de
100x con aceite de inmersión.
(Las preparaciones conservan su coloración si se mantienen alejadas de la luz)

Resultados
Con una gota de aceite de inmersión observamos la extensión con el objetivo de 100 x.
Los hematíes se habrán teñido de color verde amarillento y los reticulocitos se
diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color azul.
Se deben contar 1.000 hematíes en total, y el cálculo del porcentaje de reticulocitos es el
siguiente:
N° de reticulocitos contados x 100
% reticulocitos = N° de hematíes contados

Para descartar errores en la técnica, debemos realizar dos extensiones y hacer el


recuento en ambas, de manera que la diferencia entre ellas sea igual o menor a 5
reticulocitos.
El resultado final es la media de los dos porcentajes obtenidos.

61 hematíes
61 x 4 = 244 hematíes en 1 campo

1 campo ------ 244 hematíes


X campos------ 1000 hematíes

X= 4,09 campos
Reticulocitos observados en 4 campos:
4+4+3+2 = 13 reticulocitos

13 reticulocitos----- 1000 hematíes


X reticulocitos ------ 100 hematíes

X= 1,3 %

Interpretación clínica de los resultados:


En adultos y niños los valores normales están entre 0,5 y 1,5%.
Se produce reticulopenia o disminución en la cifra de
reticulocitos, en casos de aplasia medular, anemia ferropénica,
anemia megaloblástica y anemias que cursan con dificultad en la
eritropoyesis.
Por el contrario, hay reticulocitosis en anemias hemolíticas y post-hemorrágicas, donde
se aumenta el nivel de producción de hematíes para contrarrestar su pérdida.
La cantidad de reticulocitos expresada en tanto por ciento es un valor relativo referido a
una cifra normal de hematíes. Por ello, cuando existe una anemia con disminución en la
cantidad de hematíes se compensa con un aumento en el número de reticulocitos y
debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real.
La corrección se hace en base al valor hematocrito (HCT) del paciente, y se calcula de
la siguiente forma:

23
HCT. Paciente
% de reticulocitos corregido = % reticulocitos x HCT. Normal

Si existe una anemia muy intensa, aparece en sangre periférica un número de


reticulocitos mayor del que correspondería por regeneración eritroblástica. Esto se debe
a que el estímulo eritropoyético compensador
va acompañado de un período de maduración
intramedular más corto y una etapa de
maduración en sangre periférica más larga.
Esto se conoce como "desviación
reticulocitaria" y se observa en el frotis por la
aparición de hematíes grandes con un color
azulado (macrocitos policromáticos). Para
evitar pensar que hay una capacidad
regenerativa medular intensa se debe hacer una
segunda corrección del % de reticulocitos en
función de los días que tarda en madurar el
reticulocito en sangre periférica, y a esto se le
llama índice de producción reticulocitaria
(IPR).
Se obtiene con la siguiente fórmula:

% reticulocitos
corregido
IPR = días de maduración en sangre
periférica

Los días que tarda en madurar el reticulocito


están reflejados en la tabla 6.XVI-1., cuyos valores se han obtenido experimentalmente.
Hematocrito Tiempo de
del paciente maduración
(%) (días)
45 1
35 1'5
25 2
15 2'5

El IPR nos da un valor numérico de la estimulación


hematopoyética por encima de la actividad de la línea
base normal.
Un IPR mayor de 3 nos indica un aumento de la actividad
eritropoyética medular, mientras que un IPR menor de 2
indica una escasa actividad eritropoyética.

19/02/08

24
Título de la práctica:
Determinación del fenotipo y genotipo del sistema Rh

Fundamento de la práctica:
Podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a
distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que comprenden el sistema Rh.
La existencia o no de estos antígenos en la superficie de estos hematíes se detecta por
una reacción de aglutinación. Los resultados de estas reacciones se trasladan a una
tabla donde podemos ver los posibles genotipos correspondientes.

Materiales utilizados:
•Tubos de centrífuga
•Centrífuga
•Rotulador de vidrio
•Pipetas Pasteur desechables
•Gradilla
•Reactivos:
Suero anti-D
Suero anti-E
Suero anti-C
Suero anti-e
Suero anti-c
Solución salina fisiológica
•Suspensión de hematies lavados, al 5% en ssf.
Procedimiento:
1°- Procedemos al lavado de los hematíes y a preparar su suspensión al 5%.
2°- Rotulamos cinco tubos de centrífuga, cada uno con las letras D,E,C,e,c.
3°- En cada tubo añadimos una
gota del antisuero
correspondiente y una gota de la
suspensión de hematíes al 5%.
Homogeneizamos suavemente.
4°- Centrifugamos todos los
tubos durante un minuto a 1000
r.p.m.

Resultados:
Golpeamos suavemente con el
pulpejo de los dedos medio y
anular en el fondo de los tubos
para despegar el sedimento
hemático.
El resultado positivo es la
presencia de aglutinación, y se observa con la presencia de grumos rojos sobre un
líquido claro.
La ausencia de aglutinación es un resultado negativo, y se observa como la suspensión
homogénea de los hematíes en un líquido rojizo.

25
Se ha procedido a realizar la determinación de una muestra X y la aglutinación solo ha
apericido en anti-c y anti-e, comparando con la tabla significa que el paciente será
dce/dce por consiguiente Rh-.

Interpretación clínica de los


resultados:
Un resultado positivo indica la
presencia del antígeno del sistema
Rh buscado en ese tubo. El resultado
negativo indica lo contrario.
Los cinco resultados obtenidos
expresan el fenotipo de la sangre
analizada y se comparan con los
contenidos en la tabla de fenotipos y
genotipos del sistema Rh.
Una vez encontrada la hilera
coincidente, se mira en ella el
posible o posibles genotipos
correspondientes.
Esto es así porque si la sangre
analizada es Rh negativa (D-), se
puede determinar su único genotipo
posible con respecto al sistema Rh.
Sin embargo, si la sangre es Rh
positiva (D+), existen varios
genotipos posibles que dan lugar al
fenotipo previamente detectado.

26
29/01/08

Título de la práctica:
Lavado y suspensión de hematíes

Material:
• Pipeta Pasteur
• Pipeta de 5 ml.
• Tubos de centrífuga
• Sangre total
• S.S.F

Procedimiento:
1. El tubo que contiene la sangre se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 10
min.
2. Retiramos el plasma de la sangre total con una pipeta Pasteur.
3. Con otra pipeta añadimos, más o menos, la misma cantidad de S.S.F.
4. Centrifugamos a 3000 r.p.m. durante 10 min.
5. Retiramos el sobrenadante
6. Se repiten los dos pasos anteriores dos veces más, hasta que el
sobrenadante sea transparente.

Resultados:
Para una suspensión al 5% en un frasco de 10 ml. Se harán
los siguientes cálculos:
100 ml. Suspensión------------ 5 ml. De hematíes
10 ml. Suspensión-------------- X

X= 0,5 ml hematíes
y 9,5 ml. De S.S.F.

27
08/01/08

Título de la práctica:
Capacidad total de fijación del hierro (CTFH)

Fundamento:
La transferrina sérica se satura con un exceso de Fe3+ y
el exceso no fijado se elimina por precipitación con
carbonato magnésico, determinándose a continuación la
cantidad total de hierro presente. La diferencia entre la
capacidad de fijación total de hierro hallada (CFTH) y el
hierro sérico inicial (Hb) nos da la capacidad de fijación
de hierro no saturado o residual.

Material:
• Centrífuga para muestras.
• Equipamiento habitual de laboratorio
• Micropipeta
• Fotocolorímetro
• Cubetas para fotocolorímetro
• Suero o plasma heparinizado. Libre de hemólisis. Separado lo antes posible de
los hematíes.

REACTIVOS
R5
Solución Solución de hierro 500 ug/dL
Saturante

R6
Magnesio carbonato
Agente
Precipitante
REACTIVOS ADICIONALES
El sobrenadante obtenido se procesa como muestra para la determinación del hierro:
Hierro TPTZ manual Ref: 1001240
Hierro TPTZ Ref: 1001242, 1001243
Hierro Nitro PAPS Ref: 1001244, 1001245
Hierro FerroZine Ref: 1001247, 1001248

Procedimiento:
1. Pipetear en los tubos:
Muestra (mL) 0,5
R 5 Solución saturante (mL) 1,0
2. Mezclar e incubar bien 10 minutos a Tempetarura ambiente (15-25 ºC)
3. Añadir a cada tubo:
R 6 Agente precipitante en polvo usando la cuchara que
viene con el kit, aproximadamente 70 mg= 1 dosis. Añadir
3 dosis
4. Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente

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5. Centrifugar 15 min. a 3000 r.p.m.
6. Recoger el sobrenadante, cuidadosamente y procesar como una muestra para
la determinación de hierros
Resultados:
Se calcula según lo indicado en las instrucciones de trabajo de la determinación
de hierro.
CFTH = Concentración de hierro en el
sobrenadante x 3 (Factor de dilución)

VALORES DE REFERENCIA
Suero o plasma:
200 – 400 µg/dL = 36-72 umol/L
Estos valores son orientativos. Es
recomendable que cada laboratorio
establezca sus propios valores de
referencia.

Absorvancias medidas:
Blanco Patron Muestra
1º Medicion 0,000 0.515 0.477
2º con TPTZ 0,000 0.021 0.105

(A2- A1) Muestra X 100 (conc. patrón) = μg/dl de Fe en muestra


(A2- A1) Patrón

(0,477- 0,105) Muestra X 100 (conc. patrón) = 83,3 μg/dl de Fe en muestra


(0,515- 0,021) Patrón

CTFH= 83,3 X 3 = 249,9 μg/dl


El resultado está dentro de los valores considerados como normales.

Interpretación de los resultados:


El hierro es el constituyente de un gran número de
enzimas. La mioglobina, proteína muscular,
contiene hierro, así como el hígado. El hierro es
necesario para la producción de hemoglobina,
molécula que transporta el oxígeno en el interior de
los glóbulos rojos. El hierro se controla,
normalmente, junto con la capacidad de fijación
total del hierro (CFTH), y nos indica la capacidad
de unión sérica disponible.
Encontramos niveles altos de CFTH en la anemia
ferropénica. Niveles bajos en hemocromatosis,
cirrosis, hepatitis aguda.
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en
cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

29
15/01/08

Título de la práctica:
Determinación de la Velocidad de
Sedimentación Globular (VSG)

Fundamento:
Para la medición de la VSG, se coloca la
sangre problema en el interior de un tubo
dispuesto verticalmente. En estas
condiciones los glóbulos rojos de la
sangre tienden a ir cayendo, a favor de la
fuerza de la gravedad, hacia la parte
inferior del tubo.
En condiciones normales este proceso es
lento, pues la fuerza con la que es atraído
cada hematíe hacia el fondo del tubo es
casi compensada por la fuerza ascendente
creada por el plasma al desplazarse hacia
arriba.
La VSG equivale a la longitud del
recorrido que desciende la columna de
eritrocitos, desde la parte superior del
tubo hacia abajo, en un intervalo de
tiempo.

Material:
•Tradicionalmente se han usado las pipetas y la gradilla de Westergreen.
Recientemente se han incorporado al mercado sistemas semiautomáticos que constan de
una bomba de succión que aspira la sangre hasta enrasar las pipetas a 0.
Sin embargo, son más recomendables otros sistemas que permiten una aspiración sin
riesgos de la sangre y además son de fácil realización y bajo costo. El sistema Eritrosed
consta de los siguientes elementos:
– Pipetas desechables de vidrio. Cada una de ellas tiene un diámetro externo de
2,4 mm y un diámetro interno de 2,1 mm. Están graduadas en mm, con marcas
blancas, desde el O hasta el 170. En su interior albergan un émbolo de
aspiración de plástico blanco.
– Gradilla especial, con unas perforaciones en su base, para situar los tubos
mezcladores, y con otras, en su parte superior y media, que permiten soportar
verticalmente las pipetas al ser atravesadas por éstas. Además, consta de una
corredera superior para atrapar las puntas de los émbolos.
•Tubos mezcladores de polipropileno con tapones de goma perforable
•Reloj avisador.
Reactivos
•Se recomienda el uso de citrato sódico al 3,8% como anticoagulante, pero también
se puede utilizar el EDTA.
Sin embargo, no se deben emplear otros anticoagulantes como la heparina, pues altera el
potencial zeta de los hematíes, ni los oxalatos, pues encogen las células sanguíneas.
Lo ideal es que el citrato sódico al 3,8% esté contenido en tubos mezcladores
apropiados.

30
Muestra
•Se recomienda el empleo de sangre venosa anticoagulada con citrato sódico al 3,8%
en una proporción de 4 a 1 (al 20%).
Lo ideal es recoger la sangre en tubos mezcladores, que contienen 0,4 ml de citrato
sódico al 3,8%, y al que se añade sangre venosa problema, hasta el nivel de 2 ml
marcado en el tubo mezclador.
• Si sólo se dispone de sangre anticoagulada con EDTA, se puede utilizar una
mezcla de 2 ml de esta sant con 0,5 ml de citrato sódico al 3,8% o con 0,5 ml
de cloruro sódico al 0,85%.
• En cualquier caso, la muestra siempre ha de estar libre de hemólisis.

Procedimiento:
1. Realizar la prueba:
• A temperatura ambiente (20-25 °C), pues a
mayor temperatura asciende la VSG y a menor
temperata disminuye la VSG (debido a que
aumenta la viscosidad de la sangre).
• Antes de las 3 primeras-horas transcurridas
desde la extracción de la muestra, pues, tras ese
tiempo, los hematíes tienden a adoptar una
forma esférica y desciende la VSG.
Este tiempo puede prolongarse a 12 horas si se
utiliza corno anticoagulante el EDTA y si se
conserva la sangre a 4 °C.
2. Mezclar suavemente la sangre y el anticoagulante contenidos en el tubo
mezclador.
3. Situar el tubo mezclador en una de las perforaciones de la base de la gradilla
para VSG.
4. Introducir una pipeta de VSG a través de las perforaciones superior y media de
la gradilla que están localizadas sobre el tubo mezclador correspondiente, y
presionar con la pipeta sobre el tapón de éste hasta que su punta lo perfore y
alcance el fondo del tubo.
5. Desplazar la corredera superior de la gradilla para atrapar la punta del émbolo de
la pipeta, que sobresale.
6. Tomar la gradilla con ambas manos y agitarla suavemente para asegurar una
correcta mezcla de la sangre y del anticoagulante.
7. Tirar del émbolo hasta el final de su recorrido y romper el mismo por la zona
más débil que tiene para este fin.
De esta forma se aspira la sangre
hasta el enrase O, de una manera
fácil y sin formación de burbujas
que pueden interferir en los
resultados de la prueba.
Además, al usar pipetas
desechables también se evita la
interferencia de la suciedad y
humedad que pueden estar
presentes en pipetas reutilizadas.
8. Ajustar el reloj avisador al tiempo
de lectura previsto.

31
9. Dejar reposar la sangre durante ese tiempo sin que sea afectada por vibraciones.
El diseño de la gradilla para VSG asegura que, una vez colocada en ella la
pipeta de VSG, ésta se halla dispuesta con una posición perfectamente
vertical, es decir, con su eje longitudinal perpendicular a la base de la
gradilla. Esto es importante, ya que una inclinación de la pipeta hace que
aumente el resultado de la VSG.

Resultados:
La lectura se efectúa a la primera hora y a la segunda hora.
Con el paso del tiempo se delimita una zona de separación entre la columna de
eritrocitos y el plasma.
Al final del tiempo de lectura previsto, se mira en la escala graduada de la pipeta, la
marca que coincide con el límite de separación entre los hematíes y el plasma.
El resultado se puede expresar de dos maneras:
• Longitud en mm del recorrido descendente de la columna de glóbulos rojos en
una hora (VSG de la primera hora) y en dos horas (VSG de la segunda hora).
Índice de Katz, que se calcula con la siguiente fórmula:
VSG 2ºh.
VSG 1ºh. + _________
Índice de Katz= _____________2_______
2
•Los valores normales de VSG son los expuestos a continuación:
VSG la hora 2a hora
Varones 2-7 mm 8-15 mm
Mujeres 3-10 mm 12-20 mm
Resultado obtenido 34 mm. Se produjo un error durante el proceso de medición.
Interpretación clínica de los resultados:
La VSG varía, fisiológicamente, en determinadas circunstancias. Así pues, es más alta
en la mujer, y aumenta en la vejez y a partir del tercer mes del embarazo.
En esta última circunstancia, sus valores vuelven a la normalidad, un mes después del
parto.
El aumento de las proteínas plasmáticas (sobre todo el del fibrinógeno y el de las
globulinas α2 , β y γ) produce una alteración en las propiedades físico-químicas del
plasma que conlleva un bloqueo de las cargas eléctricas negativas de los hematíes. Este
bloqueo acarrea un apilamiento de los eritrocitos y, por tanto, una formación de
agregados de glóbulos rojos. Los agregados hemáticos, al ser más pesados y al tener un
área superficial más baja (en comparación con su volumen) que los hematíes aislados,
descienden más fácilmente mientras el
plasma asciende.
Debido a lo anterior, la VSG aumenta en
alto grado en enfermedades en las que hay
una hiperproducción de inmunoglobulinas
monoclonales (neoplasias malignas de las
células plasmáticas) y, en menor grado, en
enfermedades que cursan con un aumento
inespecífico de las inmunoglobulinas (por
ejemplo, las enfermedades autoinmunes) o
con un ascenso de las proteínas
involucradas en la inflamación, es decir, de

32
los reactantes de fase aguda (fibrinógeno, alfa-1 antitripsina, alfa-1 glucoproteína,
haptoglobina y ceruloplasmina). Este último caso es el más frecuente y es propio de las
enfermedades infecto-inflamatorias.
Por el contrario, la VSG desciende en las hepatopatías graves que conllevan una
hipoproducción de fibrinógeno.
El número, el tamaño y la forma de los glóbulos rojos también alteran la VSG. Así
pues:
• En las anemias aumenta la VSG debido a que un número pequeño de
hematíes, englobado en un gran volumen de plasma, sedimenta con
mayor facilidad. Sin embargo, en las
poliglobulias disminuye la VSG debido a
que se incrementan las fuerzas de fricción
existentes entre los eritrocitos.
• En la macrocitosis asciende la VSG debido
al mayor peso y a la menor área superficial
relativa de los hematíes. Por razones
opuestas, en la microcitosis desciende la
VSG.
• En las proliferaciones de formas anómalas
de los glóbulos rojos, la formación de
apilamientos está dificultada y, por
consiguiente, disminuye la VSG.
La alteración de la VSG es un indicador altamente inespecífico, ya que sólo señala la
presencia de una enfermedad activa, pero no ofrece casi datos acerca del tipo de proceso
patológico que la origina ni de la gravedad de éste.
Sólo en algunas ocasiones su grado de ascenso es directamente proporcional a la
severidad con la que cursa la enfermedad subyacente, por lo que puede ser utilizada
para controlar la evolución de algunas enfermedades (artritis reumatoidea, lupus
eritematoso diseminado, endocarditis bacteriana aguda, tuberculosis, etc.)

33
26/02/08

Título de la práctica:
Determinación de Coombs directo

Fundamento:
Consiste en enfrentar los hematíes del paciente al suero de Coombs específico, para
determinar si existen o no autoanticuerpos fijados en la membrana eritrocitaria. Su
presencia se manifiesta por la
aglutinación de los hematíes en el fondo
del tubo.
En esta técnica es importante realizar el
control del suero de Coombs con hematíes
previamente preparados, esto nos
permitirá saber en qué condiciones se
encuentra y si los resultados obtenidos
son válidos.
No hemos utilizado anti C3-C4
Material:
•Tubos de hemólisis.
•Centrífuga.
•Pipetas Pasteur.
•Baño de agua.
•Gradilla.
•Rotulador de vidrio.
Reactivos
•Solución salina fisiológica.
•Suero de Coombs anti-IgG.
•Suero anti-D incompleto (IgG).
•Hematíes normales no sensibilizados.
•Hematíes Rh (D) positivos.
•Sangre del grupo O sin anticoagulante.
Muestra
Hematíes del paciente preparados de la siguiente manera: Centrifugar la sangre para
separar el plasma. Tomar un volumen de hematíes y lavar cuatro
veces con solución salina fisiológica. Posteriormente resuspenderlos
en esta solución al N-5%.
Procedimiento:
1. Preparación de los hematíes control:
• Hematíes normales no sensibilizados: Lavar los
hematíes cuatro veces con solución salina fisiológica y
resuspenderlos en la misma al 2-5%.
• Hematíes sensibilizados con IgG: Lavar los hematíes Rh positivos cuatro
veces en solución salina fisiológica y resuspenderlos en la misma al 50%.
Incubamos 0,1 ml de esta suspensión con 0,1 ml de suero antiD
incompleto, durante 1 hora a 37 °C. Posteriormente lavar cuatro veces con
solución salina y resuspender en la misma al N-5%.
2. Técnica:

34
•Rotulamos tres tubos de hemólisis con las letras C 1 , C2, P1.
•En el tubo C1 añadimos una gota de los hematíes normales no
sensibilizados y una gota de suero de Coombs anti-IgG.
•En el tubo C2 añadimos una gota de los hematíes sensibilizados con IgG y
una gota de suero de Coombs anti-IgG.
•En el tubo P1 añadimos una gota de los hematíes del paciente y una gota del
suero de Coombs anti-IgG.
Centrifugamos todos los tubos a 3.000 r.p.m. durante 45 segundos. Observamos la
presencia o la ausencia de aglutinación en los tubos

Resultados:
Después de centrifugar,
golpeamos suavemente
con el pulpejo de los dedos
anular e índice para
despegar el sedimento
hemático en todos los
tubos.
Los tubos que presentan
aglutinación indican un
resultado positivo, es
decir, la presencia de
anticuerpos sobre la
membrana eritrocitaria.
El tubo C1 es un control
negativo, y no debe
aparecer aglutinación. De ser positivo, los resultados no son válidos.
El tubo C2 es un controle
positivo, y siempre deben presentar
aglutinación. De no ser así, indica
que el suero de Coombs no está en
buenas condiciones para su
utilización.
Ha habido aglutinación en el
tubo P1, por lo tanto en la
membrana eritrocitaria hay
anticuerpos Ig-G.

Interpretación clínica de los


resultados:
En el caso de utilizar también
anti C3-C4 si los hematíes del paciente presentan aglutinación con el suero de Coombs
anti-IgG y no con el suero antiC3-C4, indica que los autoanticuerpos son del tipo IgG.
Si la aglutinación se produce con el suero anti-C3-C4 y no con el anti-IgG, indica que
existe complemento fijado a la membrana eritrocitaria por IgM o IgG. Estas
inmunoglobulinas no se ponen de manifiesto con el suero anti-IgG debido a su poca
afinidad por la membrana eritrocitaria y se eliminan con el lavado de los hematíes.
Si existe positividad con ambos antisueros indica que la anemia hemolítica
autoinmune es de naturaleza mixta.

35
Hay que tener en cuenta que existen factores que pueden dar error en esta prueba,
tanto falsos positivos como falsos negativos, y que se resumen a continuación:
•Falsos positivos:
1.Se puede producir una sensibilización "in vitro" de los hematíes al mantenerlos
durante cierto tiempo a 4 °C.
2.Lavar insuficientemente los hematíes.
3.Utilización de un suero de Coombs que posee anticuerpos capaces de unirse a
hematíes no sensibilizados.
4.Contaminación bacteriana de la sangre.
5.Reticulocitosis elevada en la muestra analizada.
6.Reacción con la sílice coloidal de los tubos de cristal
•Falsos negativos:
1.Tiempo de centrifugación
insuficiente.
2.Suero de Coombs en mal
estado.
3.Cuando el autoanticuerpo
es de tipo IgA.
4.Lavado de los hematíes
incorrecto.
5.Empleo de sangre
caducada.
6.Empleo de tubos sucios o
con restos de jabón.

26/2/08

Título de la práctica:

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Test de Coombs indirecto

Fundamento:
Investigar la presencia de anticuerpos irregulares o incompletos en el suero del
paciente enfrentándolos, primeramente, a hematíes específicos tipados y,
posteriormente, a la AGH para su detección.

Material:
• Material para el lavado y la dilución de los hematíes.
• Portaobjetos, cubreobjetos y tubo de hemólisis.
• Pipeta de Pasteur y visualizador.
• Baño termostático y microscopio.

REACTIVOS
• AGH y SF.
• Hematíes tipados del grupo 0+.

MUESTRA
• Suero problema.

Procedimiento:
PROCEDIMIENTO 1: PREPARACIÓN DE LOS HEMATÍES TIPADOS 0+
1. Realizar una determinación de grupo celular sobre los hematíes tipados 0+ para
comprobarlo.
2. Efectuar un lavado y una dilución de los hematíes tipados O+ al 5 %
3. Realizar prueba de Coombs directa sobre los hematíes tipados 0+ para
comprobar que no existen anticuerpos irregulares sobre ellos.
PROCEDIMIENTO 2: DETERMINACIÓN DE COOMBS INDIRECTO
1. En un tubo de hemólisis depositar 2 o 3 gotas del suero problema.
2. Añadir al tubo unas 2 o 3 gotas de la suspensión de hematíes tipados 0-, al 5 % y
agitar suavemente.
3. Incubar la mezcla en baño termostático durante 15-30 min.
4. Lavar la mezcla con 1 ml de SF.
5. Repetir este lavado 2 veces más.
6. Al sedimento obtenido con el último
lavado añadir 2 o 3 gotas de AGH.
7. Centrifugar a 2.500 rpm durante 1
min.
8. Resuspender el sedimento obtenido
con el último lavado dando pequeños
golpecitos en el fondo del tubo; si es
necesario, añadir unas gotas de SF.
9. Observar la presencia o ausencia de
aglutinación en
el visualizador,
y si es
necesario, en el
microscopio.

Resultados:

37
Comprobación de la aglutinación a nivel microscópico: observa en el microscopio con
el objetivo de 40x:
•Presencia de aglutinación (+): se observan los hematíes agrupados en grumos sobre fondo
claro.
Ausencia de aglutinación (-): se observan los hematíes separados y distribuidos por todo
el campo de forma homogénea.
Es positivo ya que se observa presencia de aglutinación de los hematíes.

Interpretación clínica de los resultados:


El examen de Coombs indirecto detecta anticuerpos circulantes contra los glóbulos
rojos (GR). El propósito principal de este examen es determinar si el paciente tiene
anticuerpos en el suero capaces de adherirse a los glóbulos rojos (aparte de los del
sistema principal ABO o los de tipo Rh).
Esta prueba se utiliza sólo raras veces para diagnosticar una condición médica, pero su
uso es esencial para laboratorios como los bancos de sangre. El examen de Coombs
indirecto se utiliza en los bancos de sangre para determinar si
probablemente haya una reacción adversa a la sangre que va a ser
utilizada para una transfusión sanguínea.
Marca con ‹‹+/-» si existe o no aglutinación en el siguiente cuadro y
valora el resultado:
HEMATÍES
MUESTRA
Aglutinación
en tubo
Aglutinación
Microscópic
•Si la prueba de Coombs a tiene un resultado negativo, se agregan
hematíes control sensibilizados con IgG que deberán dar resultado
positivo de aglutinación. Esto confirmará que la AGH no ha
reaccionado primeramente con la muestra-problema y que, realmente,
en ella no existen hematíes problema que poseen anticuerpos
irregulares sobre su membrana.
HEMATÍES
CONTROL
Aglutinación
en tubo
Aglutinación
microscópica
Expresa H prueba realizada de Coombs es directo es positiva o es negativa para los
hematíes problema y valora el resultado.

21/02/08

Título de la práctica:
Prueba cruzada mayor

Fundamento:
Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero

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en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último frente al suero
antiglobulina de Coombs. Con este último paso detectáremos los anticuerpos que se
hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.
Es importante respetar los tiempos de incubación para evitar posibles errores en la
técnica.

Material:
• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
• Baño de agua.
• Pipetas Pasteur.
• Gradilla.
• Reloj.
Reactivos
•Solución salina fisiológica.
•Albúmina bovina al 30%.
•Suero antiglobulina de Coombs.
Muestra

•Suero del receptor, obtenido de sangre


coagulada y libre de hemólisis. Debe ser
fresco (menos de 24 horas desde la extracción) y conservado a 4 °C.
Hematíes del donante, previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica y
resuspendidos en ella al 2-5%.

Procedimiento:
1.En un tubo de hemólisis depositamos una gota de la suspensión de hematíes del
donante y 2 gotas del suero del receptor.
2.Mezclamos suavemente, y dejamos a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
3.Centrifugamos a 3.500 r.p.m. durante 30 segundos.
4. Leemos el resultado obtenido en medio salino.
5.Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina bovina al 30%.
6.Mezclamos bien e incubamos a 37 °C durante 30 minutos.
7.Centrifugamos a 3.500 r.p.m. durante 30 segundos.
8.Leer el resultado
obtenido en medio
albuminoso.
9.Lavamos tres veces los
hematíes con solución
salina para eliminar los
anticuerpos que no se han
fijado a los eritrocitos.
Retirar bien todo el
sobrenadante del último lavado.
10.Añadimos al tubo una gota de suero antiglobulina humana de Coombs. Mezclar
bien.
11.Centrifugamos a 1.000 r.p.m durante 2 minutos (véase figura 55.LXIV).
Leemos los resultados.

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Resultados:
La lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botón hemático con suavidad
después de cada una de las centrifugaciones.
En caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y
cubre con objetivo de 40x.
No se ha producido aglutinación, por tanto son compatibles.
Interpretación clínica de los resultados:
La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles, y
por tanto, la transfusión es posible.
La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad.
Si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, también es signo de
incompatibilidad.
En ocasiones es conveniente realizar esta prueba en medio enzimático. Dado que el
empleo de enzimas como la Bromelina o la Papaína refuerza las reacciones antígeno-
anticuerpo, esta prueba se usa para re-examinar a los receptores que han sufrido
reacciones transfusionales.

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