BIOLOGÍA MOLECULAR

DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN, PUREZA E INTEGRIDAD DE ADN

Porfirio Raúl Galicia García.

Universidad Tecnológica de Tecámac. División de Biotecnología

I. INTRODUCCIÓN
Uno de los elementos básicos del desarrollo de la Biología molecular es la posibilidad de separar fragmentos
de DNA, la técnica de electroforesis ofrece buena resolución y es generalmente el método de fraccionamiento
más utilizado. La electroforesis se basa en la capacidad de las moléculas con una carga eléctrica para
desplazarse en un campo eléctrico, con una velocidad proporcional a su carga e inversamente proporcional a
su tamaño. Las moléculas de DNA poseen a pH alcalino, una carga negativa uniforme por unidad de masa, lo
que hace que su movilidad hacia el ánodo solo este determinada por el tamaño de la molécula [1].
La separación por electroforesis de ácidos nucleicos (DNA/RNA) es una técnica analítica que proporciona
resultados cualitativos (Bueno, malo, poco, mucho), y resuelve fragmentos de DNA que van desde, 0.5 a 25
Kb. La agarosa es un polímero lineal que se extrae de algas marinas. El gel se prepara con distintas
concentraciones en función del tamaño de los fragmentos de ADN. Los geles de agarosa se realizan mediante
la fundición de la agarosa en presencia del buffer de electroforesis hasta lograr una solución transparente;
entonces la solución resultante es vaciada en un molde hasta que endurezca; una vez que solidifica, la agarosa
forma una matriz cuya densidad es determinada por la concentración [2,3].
Otra forma de estimar la cantidad de ADN es por espectrofotometría. Los dobles enlaces conjugados de las
bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos absorban luz (UV). El espectro de absorción característico
de ADN presenta un máximo a λ ~ 260 ηm. Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico en
particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración
a partir del valor de A260 ηm [4].

Cantidad de Agarosa(% [w/v]) Rango eficiente de separación de ADN lineal (Kb)

0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3
2.0 0.1-2
El objetivo de esta práctica determinar la cantidad y calidad de las muestras de ADN que se obtuvieron en la
sesión anterior, mediante electroforesis en geles de agarosa y en el espectrofotómetro de luz ultravioleta.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

Balanza analítica, Parrilla eléctrica, Cámara de electroforesis horizontal (cámara, porta-geles, cables y dos
peines), Fuente de poder, Transiluminador UV, Micropipeta de 0.5 a 10 µL, Rack con puntas limpias y
estériles blancas, Matraz Erlenmayer estéril de 250 mL, Probeta de 100 mL, Espátula de níquel, Espátula
ancha, Agarosa, buffer TAE 1X (500 mL), Buffer TBE 1X, solución de Bromuro de etidio (1µg/mL),
solución de Azul de bromofenol o buffer de carga 2X, Papel parafilms 10 cm, Atomizador con alcohol al
70%, recipiente para puntas, guantes de polivinilo, Espectrofotómetro de luz UV, celdas para
espectrofotometro, rollo de papel, contenedor con hielo para tubos eppendorf.
1. Limpiar la cámara de electroforesis y el porta-gel con alcohol y papel. Sellar los extremos del portageles
con cinta adhesiva.
2. Inmovilizar, adecuar y nivelar el porta-gel.
3. Disolver la cantidad de agarosa necesaria para el gel al 0.8 % en 75 ml de buffer TAE 1X, en un matraz
sobre la parrilla eléctrica para alcanzar el punto de ebullición y agitar hasta que desaparezcan los grumos
4. Esperar a que la temperatura descienda a 40 o 50 °C aproximadamente y adicionar 1 µL de bromuro de
etidio, homogenizar con la punta de la micropipeta (desechar la punta en los residuos peligrosos).
5. Vaciar la mezcla sobre el molde porta-gel de la cámara, Colocar el peine para que se formen los pozos y
esperar a que solidifique.

6. Una vez solidificado el gel colocarlo dentro de la cámara de electroforesis.

7. Agregar buffer TAE 1X hasta cubrir el gel y retirar el peine o peines.
8. Elaborar un diagrama del gel para la colocación e identificación de las muestras.
9. Con ayuda de la micropipeta mezclar 3 µL de buffer azul de bromofenol 2x y 5 µL de muestra de ADN
sobre el papel parafilm, mezclarlos con la micropipeta y cargarlos a los pozos en el siguiente orden:
1=control positivo, 2=control negativo (agua), 3=ADN previamente extraído de cada equipo.
10. Colocar la tapa a la cámara y conectar los cables de los electrodos a la fuente de poder (mismo color) y
encender la fuente de poder.
11. Programar la fuente de poder a 75 Volts por 30 minutos aproximadamente.
12. Durante los 30 min. que ocurre la electroforesis, encender el espectro al menos 15 minutos antes de iniciar
las lecturas, tomar una celda del espectro y colocar 50 µL de solución de ADN y el resto de buffer en una
celda del espectro, tomar la lectura a 260, 280 y 230 ηm para cuantificar el ADN y determinar pureza.
13. Terminada la electroforesis apagar la fuente de poder y desconectar los cables.
14. Retirar con cuidado el gel con ayuda de una espátula ancha y transferirlo al transiluminador UV.
15. Encender el transiluminador, observar los resultados y tomar fotografías.
16. Retirar el gel de la cámara y colocarlo en el contenedor de residuos peligrosos.
17. Retirar el buffer de la cámara y limpiarla con alcohol y papel al igual que el transiluminador.
18. Lavar material con agua y jabón.
19. Entregar el material limpio y el lugar de trabajo.

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Elaborar un informe escrito con la estructura indicada en la rúbrica. Centrar la discusión en las actividades
realizadas discutiendo cada uno de los pasos de la práctica. En tu reporte coloca esquemas claros y con una
pequeña descripción de los que se observa. Incluye la foto del gel e interpreta los resultados en cada carril.

IV. CONCLUSIONES
Se redactarán de acuerdo con los objetivos planteados en la práctica, se indicará si se lograron en caso
contrario indicar las posibles sugerencias que permitan hacerlo.

V. LITERATURA CONSULTADA
1. Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria. 2001. Detección e identificación de fitopatógenos de
importancia cuarentenaria mediante PCR. DGSV, SAGARPA. México D. F.
2. Mas Oliva, J. 1992. Aislamiento y caracterización del DNA. Mensaje Bioquímico. Fac. de Medicina
UNAM. XVI:95-104.
3. Upcroft P., J. A. Upcroft. 1993. Comparison of properties of agarose for electrophoresis of DNA. J.
Chomatography 618:79-93.
4. Zárate S. P. B., C. A. Jiménez-Sierra, J. A. Badillo-Corona, C. Garibay-Origel, Ma. del C. Oliver-
Salvador. 2009. Manual de laboratorio de biotecnología molecular. UPIBI. IPN. México D. F. 52 p.