CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1. Cuantificación de Proteína mediante la medida de la absorbancia a 280 nm

Existen diversos métodos para estimar la concentración de proteína. Uno de los más simples es
medir la absorbancia a 280 nm. Las proteínas absorben luz UV a 280 nm principalmente debido
a la presencia de los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano y a los puentes disulfuro entre
residuos cisteína (fenilalanina, que es también un aminoácido aromático, absorbe a 260 nm con
mucha más eficiencia que a 280 nm).

La fenilalanina, la tirosina y el triptófano tienen cadenas laterales aromáticas

Los aminoácidos apolares alifáticos y aromáticos suelen encontrarse enterrados en el interior

de la proteína y están involucrados en interacciones hidrofóbicas entre ellos. La tirosina tiene
un grupo hidroxilo débilmente ácido y puede localizarse en la superficie de las proteínas. La
fosforilación reversible del grupo hidroxilo de la tirosina en algunas enzimas es importante en la
regulación de las vías metabólicas. Los aminoácidos aromáticos son responsables de la
absorción ultravioleta de la mayoría de las proteínas, que presentan un máximo de absorción a
unos 280 nm. El triptófano tiene una absorción mayor en esta región que la fenilalanina o la
tirosina. El coeficiente de absorción molar de una proteína es útil para determinar la
concentración de una proteína en disolución mediante espectrometría. En la figura 1 se muestra
el espectro de absorción típico de los aminoácidos aromáticos y de una proteína.

Fig. 1 Espectros de absorción ultravioleta de los aminoácidos aromáticos y de la albúmina sérica bovina.
(A) Aminoácidos aromáticos como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina tienen un máximo de
absorbancia a 260-280 nm. Cada proteína purificada tiene un coeficiente de absorción distinto, de
alrededor de 280 nm, dependiendo de su contenido en aminoácidos aromáticos. (B) Una disolución de
albúmina sérica bovina (1 mg disuelto en 1ml de agua) tiene una absorbancia de 0,67 a 280 nm utilizando
una cubeta de 1cm. El coeficiente de absorción de las proteínas se expresa con frecuencia como
E 1% (10 mg/ml de solución). Para la albúmina, E 1% 280 nm = 6,7. Aunque las proteínas varían en su
contenido de Trp, Tyr y Phe, las mediciones de absorbancia a 280 nm son útiles para la estimación de la
concentración de proteínas en las disoluciones.
Dado que diferentes proteínas tienen diferentes cantidades de aminoácidos con cadenas
laterales aromáticas, habrá variabilidad en el grado al cual diferentes proteínas absorban luz a
280 nm. Además, las condiciones que alteran la estructura terciaria de una proteína (tipo de
tampón, pH y agentes reductores) pueden afectar a su absorbancia. Pese a la variabilidad, la
lectura de la absorbancia a 280 nm se usa frecuentemente, ya que son pocas las sustancias
químicas que también absorben a esa longitud de onda.

Como aproximación muy somera, una unidad de absorbancia a 280 nm es igual a 1 mg

proteína/mL. La solución con proteína a analizar debería ser diluida si su absorbancia a 280 nm
es mayor que 2,0.

Problema 1

Una solución de una proteína purificada se diluye dispensando 0,2 mL en un volumen total de
1,0 mL en una cubeta con 1 cm de recorrido para el paso de luz. La lectura de
espectrofotometría a 280 nm da un valor de 0,75. ¿Cuál es la estimación somera de la
concentración de proteína?

Solución 1

Este problema puede ser resuelto estableciendo la siguiente regla de tres:

1mg/mL1unidad de absorbancia=xmg/mL0,75unidades de absorbancia

La resolución de la x da el siguiente resultado:

(1mg/mL)×(0,75)1=x=0,75mg de proteína/mL

Dado que la muestra de proteína ha sido diluida 0,2 mL/1,0 mL, para determinar la
concentración de proteína de la muestra original este resultado debe ser multiplicado por el
inverso del factor de dilución:

0,75mgmL×1,0mL0,2mL=3,75mg de proteína/mL

Por lo tanto, la solución de proteína purificada tiene una concentración aproximada de

3,75 mg/mL.

2. Medición de la concentración de proteína por ensayo colorimétrico: el ensayo

Bradford

Existen diversos métodos publicados para la medición de la concentración de proteína por

ensayos colorimétricos. Cada uno de ellos se basa en la interacción entre la proteína y un
reactivo químico colorante. Esta interacción conduce a un cambio de color detectable con un
espectrofotómetro. La absorbancia de una muestra proteica de concentración desconocida se
compara con una curva estándar generada a partir de una batería de diluciones de una proteína
de la cual conocemos la concentración. La concentración de la muestra desconocida es
interpolada a partir de la curva estándar.
Uno de los métodos más populares para cuantificar proteínas mediante reactivos colorantes
recibe el nombre de ensayo Bradford (en referencia a su inventor, Marion Bradford [1976]). El
método utiliza Coomassie Brilliant Blue G-250 como sustancia colorante que se une a proteínas.
Cuando la proteína se une al colorante, se produce un aumento de absorbancia a 595 nm. La
reacción de unión al colorante tiene lugar en tan sólo un par de minutos y el cambio de color es
estable por una hora. El límite inferior de sensibilidad del ensayo es aproximadamente de 200 μg
proteína/mL.

Nota: Para construir una curva estándar se deberían utilizar réplicas (al menos dos,
preferiblemente tres) de cada dilución. Sólo una muestra de cada concentración será utilizada
aquí para simplificar los cálculos.

Problema 2

Un investigador prepara diluciones de albúmina de suero bovino (BSA) en cantidades que varían
desde 10 a 100 μg en un volumen de 0,1 mL (se ajusta el volumen con tampón cuando es
necesario). Cinco mL de reactivo colorante ( Bradford, 1976 ) es añadido a cada tubo, y la mezcla
se agita con un vórtex y se deja reposar durante al menos 2 min a temperatura ambiente. La
absorbancia a 595 nm es a continuación leída con un espectrofotómetro. Se obtienen los
resultados mostrados en la Tabla 1 . Una proteína purificada de concentración desconocida es
diluida de manera que 2 μL de la misma son dispensados en un volumen total de 100 μL, los
cuales reaccionan con el reactivo colorante Bradford del mismo modo que el estándar proteico.
Su absorbancia a 595 nm es 0,44. ¿Cuál es la concentración de proteína en la muestra original
no diluida, en mg/mL?

Tabla 1
Absorbancia a 595 nm de muestras de albúmina de suero bovino (BSA) con cantidades conocidas
de proteína
μg de BSA A 595

10 0,11

20 0,21

30 0,30

40 0,39

50 0,48

60 0,58

75 0,71

100 0,88
Solución 12

Los datos se representan en un gráfico de curva estándar ( Figura 2) con Microsoft Excel). El
análisis de regresión lineal de la curva estándar da lugar a la siguiente ecuación:
y=0,0087x+0,0396

Figura 2

Gráfico para el Problema 2 .

En esta ecuación, y representa la absorbancia a 595 nm y x representa la cantidad en μg de

proteína. Dado que tenemos el valor y (0,44), podemos resolver la x :

0,44=0,0087x+0,03960,44−0,0396=0,0087x0,4004=0,0087x0,40040,0087==46

Por lo tanto, en el tubo de ensayo existen 46 μg de proteína, o, dicho de otra forma, los 2 μL
de preparación proteica que se han colocado en el tubo de ensayo contienen 46 μg de
proteína. Esto representa una concentración de 23 mg/mL en la muestra original, tal como se
muestra en la siguiente conversión:

46μg2μL×1.000μL1mL×1mg1.000μg=23mgmL

Por lo tanto, la preparación proteica original no diluida tiene una concentración de 23 mg de

proteína/mL.