4.5.

Determinación de compuestos fenólicos totales

Para determinar compuestos fenólicos totales se seguirá el método propuesto por

Singleton et al. (1999). Este método se basa en la reacción de los compuestos
fenólicos con el reactivo de Folin-Ciocalteu (mezcla de wolframato sódico y
molibdato sódico en ácido fosfórico), a pH básico, dando lugar a un complejo de
color azul susceptible de ser determinado espectrofotométricamente a 765 nm.

Se colocan 20 µL de cada extracto (o solución estándar) en microtubos de 2 mL;

posteriormente, se adicionan 1.58 mL de agua destilada a cada tubo, seguidos de
100 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 1:1 con agua destilada. Después de
5 minutos se adicionan 300 µL de solución de carbonato de sodio al 10 % y se
agita en un vortex. Las mezclas obtenidas se dejan en la obscuridad durante 2 h
para su posterior lectura en un espectrofotómetro a 765 nm. Se construye una
curva de calibración utilizando diferentes concentraciones de ácido gálico (0.1 a
0.5 mg/mL). Para efectuar el cálculo de fenólicos totales se emplea la siguiente
ecuación:

L * V * 100
CF =
M

Donde:

CF: compuestos fenólicos totales expresado como mg Equiv. gálico/100 mL.

L: valor obtenido al interpolar la absorbancia de cada muestra en la curva patrón

de ácido gálico.

M: peso de la muestra.

V: Volumen final de extracción con metanol al 80 %.

Curva tipo de fenólicos

30
Se prepara una solución madre de ácido gálico disolviendo 0.05 g del ácido en 1
mL de etanol absoluto y llevándolo posteriormente a un volumen de 10 mL con
agua destilada (concentración de 5 mg de ácido gálico/mL). Enseguida se realiza
una dilución 1:10 de la solución anterior para obtener una concentración final de
0.5 mg/mL y a partir de esta dilución se realiza la curva patrón (Cuadro 1).

Cuadro 1. Preparación de curva patrón de ácido gálico

Concentraciones µL de solución µL agua
(mg de ácido gálico/mL) (0.5 mg/mL) destilada
0 0 1000
0.1 200 800
0.2 400 600
0.3 600 400
0.4 800 200
0.5 1000 0

30
4.6. Cuantificación de flavonoides

Para determinar el contenido de flavonoides en el cacahuate se seguirá el método

descrito por Ebrahimzadeh et al. (2008). Este método está basado en la reacción
de los iones aluminio con los flavonoides, en medio alcalino, con la formación de
un complejo que absorbe luz a 415 nm.

A 0.5 mL de extracto o solución estándar de quercetina (20–100 μg/mL), se le

adicionan 1.5 mL de etanol, 0.1 mL de AlCl 3 al 10%, 0.1 mL de acetato de potasio
1 M y 2.8 mL de agua. La mezcla se deja 30 min a temperatura ambiente y se lee
la absorbancia a 415 nm en un espectrofotómetro. La concentración de
flavonoides, expresado como mg equivalentes de quercetina por 100 g de
muestra, se obtiene de la siguiente ecuación:

𝑚𝑔 𝐸𝑄 𝐿 x 20
𝐹𝑙𝑎𝑣𝑜𝑛𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠 ൬ ൰= ൬ ൰ሺ100ሻ
100 𝑔 1000 x 𝑚

Donde:

EQ = equivalentes de quercetina
L = concentración de flavonoides a partir de la curva tipo, en µg/mL
m = peso de la muestra en g
20 = mL de disolvente con que se extrajeron los flavonoides
1000 = conversión de µg a mg

La curva tipo (20 a 100 µg/mL) se prepara a partir de una solución madre de 1
mg/mL de quercetina (50 mg de quercetina disuelta y aforada a 50 mL con etanol).
Después se hace una dilución 1:10 de la solución madre para obtener una
concentración final de 100 µg/mL y a partir de esta dilución se realiza la curva
patrón (Cuadro 2).

Cuadro 2. Preparación de la curva tipo de quercetina

32
 Concentraciones mL de solución mL agua
(µg de quercetina/mL) (100 µg/mL) destilada
0 0 5
20 1 4
40 2 3
60 3 2
80 4 1
100 5 0

5.13. Determinación de actividad antioxidante

5.13.1. Método ABTS

Para determinar la actividad antioxidante de las muestras se utilizará el método de

ABTS descrito por Re y col. (1999). Este método se basa en la decoloración del
radical catiónico ABTS.+ debida a la acción reductora del agente antioxidante. El
radical catiónico ABTS•+ (de color azul-verde) es un cromóforo que absorbe a una
longitud de onda de 734 nm y se genera por una reacción de oxidación del ABTS
[(2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato de amonio)] con persulfato de
potasio. Los resultados se expresan como valores TEAC
(troloxequivalentantioxidantcapacity) mediante la construcción de una curva patrón
usando como antioxidante TROLOX® (un análogo de la vitamina E).

Preparación de soluciones

 Etanol 80%: medir 200 ml de etanol absoluto y aforar a 250 ml con agua
deionizada.

 Solución madre de Trolox 1.5 mM: pesar 0.0188 g de Trolox y aforar a 50

ml con etanol (esta solución es estable durante 6 meses a -20°C en la
oscuridad)

Obtención del radical ABTS.+

32
Para activar el radical ABTS, se hacen reaccionar el ABTS 7 mM con persulfato de
sodio 2.45 mM (concentración final). Para esto se pesan 0.0384 g de ABTS y
0.0066 g de persulfato de sodio, se disuelven en agua desionizada y se aforan a
10 ml con agua desionizada. Esta solución se incuba a temperatura ambiente en
la oscuridad durante 16-20 h (transcurrido este tiempo, la solución será estable
durante 3 días en la oscuridad).

El mismo día de su uso, agregar 1 ml de la solución de ABTS .+ a 100 ml de etanol

y medir su absorbancia a 734 nm. Ésta deberá ser de 0.7 ± 0.02 (en caso
contrario, ajustar la lectura mediante la adición de solución madre de ABTS .+ o
con etanol según sea el caso).

Preparación de la curva tipo utilizando trolox como estándar de referencia

 Preparar la curva tipo en frascos ámbar de 10 ml de acuerdo con el Cuadro

3.

 En tubos de ensayo de 10 ml mezclar 20 μL de cada solución de Trolox con

1980 μL de ABTS.+ diluido, mezclar cuidadosamente y transferir a la celda
del espectrofotómetro. Tomar la lectura de absorbancia a 734 nm, contra un
blanco de etanol, exactamente a los 6 min de haber hecho la mezcla.
Registrar la lectura como Af (señal inhibida).

 Cuadro 3. Curva tipo de Trolox

Tubo [µM Trolox] ml de solución madre mL de EtOH

1 1500 5 0
80%
2 1200 4 1
3 900 3 2
4 600 2 3
5 300 1 4

32
  Preparar una celda con la mezcla de 20 μl de etanol 80% y 1980 μl de
ABTS.+diluido. Medir la absorbancia a 734 nm a los 6 min y registrar la
lectura como A0 (blanco o señal no inhibida).

 Realizar el ensayo por triplicado.

 Calcular el porcentaje de inhibición para cada solución estándar de trolox

con la siguiente fórmula:

A734 (%) = (A0 – Af) x 100/A0

Graficar A734 (%) en el eje Y, contra la concentración de Trolox que corresponda en

el eje X. Obtener la ecuación de regresión.

Análisis de las muestras

 Seguir el mismo procedimiento descrito para la curva tipo de Trolox, pero

añadir 20 μl del extracto correspondiente en lugar del estándar de Trolox.

 Calcular el porcentaje de inhibición de la absorbancia, de la misma manera

indicada anteriormente para la curva tipo.

 Utilizando la ecuación de regresión de la curva patrón de Trolox, determinar

la concentración equivalente de Trolox correspondiente al % de inhibición
obtenido con la muestra problema. Hacer los cálculos necesarios para
expresar la actividad antioxidante en μmol ET/ g de muestra, donde ET =
equivalentes de trolox.

32
5.13.2. Método del DPPH.

Se basa en la habilidad de los antioxidantes para reducir el 2,2-difenil-1-

picrilhidrazilo (DPPH) lo cual se evidencia por la disminución de la absorbancia a
una longitud de onda de 515 nm. Se utilizó el método descrito por Brand Williams
y col. (1995).

Preparación de solución.

Se prepara la solución de trabajo disolviendo 0.0025 g de DPPH en 100 mL de

etanol.

Análisis de muestras.

Se mezclan 50 µL del extracto etanólico de las muestras o de Trolox, con 1 mL de

la solución de DPPH. Se lee la absorbancia a 515 nm después de 30 min de haber
iniciado la reacción. Se prepara una curva tipo graficando absorbancia contra
concentración de Trolox (150-750 µM). Los resultados se expresan en µmol
equivalentes de Trolox/g de muestra, de manera semejante al cálculo de actividad
antioxidante por el método del ABTS.

%Inhibición = (Abs control - Abs muestra) x 100/Abs control

Donde:

Abs control: absorbancia del DPPH sin muestra.

Abs muestra: absorbancia del DPPH después de reaccionar 30 min con la

muestra.

5.13.3. Método FRAP

Este método evalúa la capacidad antioxidante de una muestra de acuerdo con su

capacidad para reducir la forma férrica (Fe +3) del complejo hierro- 2,4,6-tri(2-
piridil)-s-triazina (TPTZ) hasta la forma ferrosa (Fe +2), la cual tiene un máximo de
absorbancia a una longitud de onda de 593 nm (Benzie, 1996).

33
Preparación de soluciones

 Reactivo de TPTZ preparar una solución 10 mM en HCl 40 mM.

 Solución de cloruro férrico tetrahidratado (FeCl3.4H2O) 20 mM.

 Regulador de acetatos 300 mM (pH 3.6): Solución A: disolver 1155 µL

de ácido acético y llevar a 100 mL con agua destilada. Solución B:
disolver 2.72 g de acetato de sodio trihidratado y llevar a 100 mL con
agua destilada. Mezclar 46.3 mL de solución A con 3.7 mL de solución B
y llevar a 100 mL con agua destilada.

 Solución de trabajo: mezclar, el mismo día de la determinación, 2.5 mL

del reactivo TPTZ con 2.5 mL de solución de FeCl 3.4H2O y 25 mL de
regulador de acetatos. Mantener la mezcla a 37 °C.

Análisis de las muestras

Mezclar 900 µL de la solución de trabajo con 90 µL de agua y 30 µL del extracto

muestra. La mezcla se mantiene a 37°C durante 30 min y se lee la absorbancia a
595 nm. Se prepara una curva tipo graficando absorbancia contra concentración
de Trolox (300-1500 µM). Los resultados se expresan en µmol equivalentes de
Trolox/g de muestra.

33
4.7.4. Actividad quelante de iones metálicos

La actividad quelante de los extractos hacia los iones fierro se midió siguiendo el
método de la ferrozina (Ebrahimzadeh et al., 2008). El reactivo ferrozina puede
cuantitativamente formar complejos con iones Fe 2+. Sin embargo, en la presencia
de agentes quelantes, se interrumpe la formación del complejo disminuyendo su
color rojo cuya absorbancia es a 562 nm.

Se prepara la mezcla de reacción con 0.5 mL del extracto y 0.05 mL de FeCl 2 2

mM. Después de 5 min se inicia la reacción con la adición de 0.1 mL de ferrozina 5
mM ajustando el volumen total a 3 mL con etanol al 80%. La mezcla se agita
vigorosamente y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. Entonces se
mide la absorbacia a 562 nm. El porcentaje de actividad formadora de quelatos se
calcula con la siguiente fórmula:

% actividad = (Abs control - Abs muestra) x 100/Abs control

33