Determinación cuantitativa de las proteínas

Lina Maria Granja Garces

Fecha de realización de la práctica: 24/04/2023

Fecha de entrega de informe: 08/05/2023

Resumen: En esta práctica se realizó la determinación cuantitativa proteínas (albumina

bovina) en distintas muestras a partir de unas concentraciones ya conocidas (desde 0.0 mL
hasta 2.0 mL . Para esto, se realizó el ensayo de Lowry, un método colorimétrico en el que a
la muestra problema se le añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las
proteínas, permitiendo así su determinación. Posteriormente, con los datos obtenidos del
espectrofotómetro, se realizó la curva de calibración, para identificar concentraciones
desconocidas de la proteína en las distintas muestras y finalmente se realizó el análisis de los
cálculos y resultados.

Abstrac:In this practice, the quantitative determination of proteins (bovine albumin) was
carried out in different samples from already known concentrations (from 0.0 mL to 2.0 mL).
For this, the Lowry test was carried out, a colorimetric method in which the problem sample,
a reagent is added that forms a colored complex with the proteins, thus achieving its later
determination, with the data obtained from the spectrophotometer, the calibration curve was
made, to identify unknown concentrations of the protein in the different samples and finally
performed the analysis of the calculations and results.

Introducción

Las proteínas son polímeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Estas moléculas,
sin grupo prostético, no absorben en el espectro visible. Los aminoácidos aromáticos tienen
nubes electrónicas, y por ello absorben luz ultravioleta, concretamente a 280 nm. La ventaja
de utilizar longitud de onda para la cuantificación de proteínas es que no estropea la muestra;
sin embargo, es poco específica y poco sensible. Si la estabilidad de la proteína no es
fundamental en un análisis, y solo se pretende enfocar el análisis en la cuantificación de la
misma, pueden emplearse métodos desnaturalizantes, más sensibles. Se pueden utilizar dos
técnicas que se describirán a continuación:
Biuret: La adición de cobre hace que se formen enlaces coordinados con los cuatro nitrógenos
de los enlaces peptídicos, apareciendo en la muestra un color azul, identificable a simple
vista. Luego, la luz que se emplea para la cuantificación (la luz que absorbe la muestra) es el
rojo (λ=700nm), en la que se presenta el máximo de absorción de este complejo.
Lowry: Es una combinación de las reacciones de la proteína con el reactivo de Biuret y con
el reactivo de fenoles (Folin). Es una prueba de Biuret reforzada, por lo que se aumenta la
sensibilidad del método de cuantificación. Las reacciones que tienen lugar empleando el
método de Lowry se desarrollan en dos fases:
a. Reacción del cobre alcalino con la proteína:
Cu2+ + Proteína → [Cu-Proteína], esta reacción es semejante a la de Biuret.
 b. Reducción del reactivo de fosfomolibdo-fosfotúgstico por la proteína tratada con Cu+2.
La técnica de Lowry es más sensible, por lo cual, se utiliza para la cuantificación de muestras
más diluidas y la de Biuret para muestras más concentradas. ((Bioquímica)

Objetivos

• Determinar la concentración de una proteína (albúmina bovina) en distintas muestras

problema a partir de concentraciones ya conocidas.
• Realizar una curva de calibración, para identificar concentraciones desconocidas, a
partir de las halladas.

Cálculos y resultados

1. Ensayo de Lowry:

Tabla 1: Resultado de absorbancia de las muestras.

Grupo Blanco Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9 P1 P3
1 0 0.132 0.254 0.401 0.479 0.571 0.664 0.762 0.870 0.201 0.033
2 0 0.228 0.328 0.580 0.524 0.576 0.675 0.685 0.916 0.269 0.096
3 0 0.148 0.375 0.496 0.452 0.607 0.700 0.799 0.837 0.223 0.094
4 0 0.170 - 0.388 0.468 0.535 0.658 0.843 0.804 0.280 0.056
Fuente: Estudiantes laboratorio de bioquímica.

Para hallar las concentraciones en cada uno de los tubos se tuvo en cuenta que la
concentración inicial de la proteína Seroalbúmina Bovina es 0.3mg/ml y haciendo uso de la
siguiente ecuación:
Teniendo en cuenta la concentración inicial de la albúmina (0.3 mg/mL) se hace uso de la
ecuación de continuidad para hallar las demás concentraciones, de la siguiente manera:

𝐶𝐶1×𝑉𝑉1 = 𝐶𝐶2×𝑉𝑉2
C1: Concentración inicial
V1: Volumen inicial
C2: Concentración final
V2: Volumen final

De esta manera, se determinó la concentración de la muestra de todos los tubos.

La siguiente, ecuación da cuenta de la concentración de la muestra del tubo 2.

0.3𝑚𝑚𝑚𝑚 ∗ 0.25𝑚𝑚𝑚𝑚
𝐶𝐶1 = 1𝑚𝑚𝑚𝑚 = 0.375𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2𝑚𝑚𝑚𝑚
 Tabla 2: Resultado de las concentraciones de cada una de las muestras

Muestra Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9
Agua (mL) 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 0
Sln. Patrón (mL) 0 0,25 0,25 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2
Proteína (mg/mL) 0 0,0375 0,75 1,1125 0,15 1,1875 0,225 0,2625 0,3
Fuente: Elaboración propia

Una vez calculada las concentraciones de las muestras, se procedió a realizar las curvas de
calibración para determinar la concentraciones de P1 y P3.
Las siguientes tablas, corresponden a las curvas de calibración de cada grupo.

Curvas de calibración
Curva de calibración Grupo 1
1,000
0,800
Absorancia

0,600
0,400
0,200
0,000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350
Concentración de Proteínas (mg/mL)

Imagen 1: Curva de calibración Grupo 1

𝑦𝑦 = 2.8267 + 0.0352
𝑅𝑅2 =0.9933

Curva de calibración Grupo 2

1,000
0,800
Absorancia

0,600
0,400
0,200
0,000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350
Concentración de Proteínas (mg/mL)

Imagen 2: Curva de calibración Grupo 2

𝑦𝑦 = 2.5444 + 0.1197
𝑅𝑅2 =0.9041

Curva de calibración Grupo 3

1,000

Absorancia 0,800

0,600

0,400

0,200

0,000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350
Concentración de Proteínas (mg/mL)

Imagen 3: Curva de calibración Grupo 3

𝑦𝑦 = 2.6942 + 0.0863
𝑅𝑅 2 =0.9489

Curva de calibración Grupo 4

1,000

0,800
Absorbancia

0,600

0,400

0,200

0,000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350
Concentración de Proteínas (mg/mL

Imagen 4: Curva de calibración Grupo 4

𝑦𝑦 = 2.7539 + 0.044
𝑅𝑅 2 =0.976

De las cuatro curvas de calibración la que tiene mejor coeficiente de correlación es la gráfica
1 (R2=0.9933) Por tal razón se va a trabajar con la ecuación de la recta de esa curva
(𝑦𝑦=2.8267𝑥𝑥+0.0352) para encontrar las concentraciones necesitadas.
Para encontrar las concentraciones de P1 y P3 se despeja la X de la ecuación de la recta
𝑦𝑦=2.8267𝑥𝑥+0.0352, de esta forma se encuentran las concentraciones experimentales, donde
Y es la absorbancia obtenida de cada muestra.

Grupo 1:

Y − 0.0352
X=
2.8266

Concentración de P1:

0.201 − 0.0352𝑚𝑚𝑚𝑚
[𝑃𝑃1] = = 0.586 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2.8266𝑚𝑚𝑚𝑚

Concentración de P3:

0.033 − 0.0352𝑚𝑚𝑚𝑚
[𝑃𝑃3] = = 0.0007 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2.8266𝑚𝑚𝑚𝑚

Grupo 2:
Y − 0.1197mg
X=
2.544mL

Concentración de P1:

0.2690𝑚𝑚𝑚𝑚 − 0.1197
[𝑃𝑃1] = = 0.0586 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2.544𝑚𝑚𝑚𝑚

Concentración de P3:
0.0940𝑚𝑚𝑚𝑚 − 0.1197
[𝑃𝑃3] = = 0.0101 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2.544𝑚𝑚𝑚𝑚

Grupo 3:
Y − 0.0863mg
X=
2.6942mL

Concentración de P1:

0.2230𝑚𝑚𝑚𝑚 − 0.0863𝑚𝑚𝑚𝑚
[𝑃𝑃1] = = 0.0507 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2.6942 𝑚𝑚𝑚𝑚

Concentración de P3:

0.0940𝑚𝑚𝑚𝑚 − 0.0863𝑚𝑚𝑚𝑚
[𝑃𝑃3] = = 0.0028 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2.6942 𝑚𝑚𝑚𝑚
Grupo 4:
Y − 0.0444mg
X=
2.7539 mL

Concentración de P1:

0.2800𝑚𝑚𝑚𝑚 − 0.0444𝑚𝑚𝑚𝑚
[𝑃𝑃1] = = 0.0855 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2.7539𝑚𝑚𝑚𝑚

Concentración de P3:

0.0560𝑚𝑚𝑚𝑚 − 0.0444𝑚𝑚𝑚𝑚
[𝑃𝑃3] = = 0.0042 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚
2.7539𝑚𝑚𝑚𝑚

Las concentraciones, de P1 y P3, calculadas para los cuatro grupos, quedaran consignadas en
la siguiente tabla:

Tabla 3: Concentración de P1 y P3, de cada grupo.

Grupo [P1] mg/mL [P3] mg/mL
1 0,0586 -0,0007
2 0,0586 -0,0101
3 0,0507 0,0028
4 0,0855 0,0042
Fuente: Elaboración propia

Análisis de cálculos y resultados

El ensayo de Lowry se basa en una doble secuencia de reacciones que terminan con la
generación de color. La primera es la reacción de Biuret, donde los enlaces peptídicos de las
proteínas reaccionan con el cobre en condiciones alcalinas para producir Cu+.
Posteriormente, el Cu+ entonces reacciona con el reactivo de Folin, en la reacción de Folin
Ciocalteau, donde, en sustancia, el fosfomolibdotungstato se reduce a azul de
heteropolimolibdeno por oxidación catalizada por Cu+. Las reacciones dan como resultado
un color azul fuerte, que depende en parte del contenido de tirosina y triptófano.
Por lo tanto, el color azul desarrollado es proporcional al contenido de proteína y puede
medirse espectrofotométricamente a 750 nm (Altervista, 2022).

Mediante la creación de las curvas de calibración y utilizando concentraciones de proteínas

conocidas como estándar fue posible averiguar las concentraciones de proteína desconocida
de las soluciones P1 y P3n, basado en la absorbancia de la solución después de la adición del
colorante.
De acuerdo con los resultados obtenidos (Ver tabla 3) se puede conocer que P1 es una
muestra con mayor concentración que P3, ya que para todos los grupos presentó una mayor
absorbancia.

Otros métodos para cuantificar proteínas

Ácido bicinconínico (BCA)

Rango de concentración: 20-2000 ug/ml

Características:
Desarrollado en 1985.
Ensayo colorimétrico donde la absorbancia será proporcional a la concentración de proteína
presente en la muestra.
Reacción en dos pasos:
Formación de complejos proteína-iones de cobre.
Formación de un quelato Cu-BCA que da lugar a una intensa coloración púrpura que absorbe
a 562nm.
Ventajas:
Es un método recomendado en el caso de muestras que contengan >5% de detergentes y/o
agentes desnaturalizantes como urea o cloruro de guanidinio.
Sensibilidad comparable a la del método de Lowry.
Limitaciones:
Las muestras que contengan sustancias que interaccionan con el cobre, como por ejemplo el
amoníaco, al igual que el EDTA, los azúcares reductores o los lípidos, pueden interferir con
este ensayo.
El color no es estable con el tiempo; se necesita controlar cuidadosamente el tiempo entre el
análisis y la lectura en absorbancia. (Abyntek, 2023)

Absorción ultravioleta (UV)

Rango de concentración: 0,1-100 ug/ml
Características:
Mediante la medición de la absorción característica que presentan el triptófano y la tirosina
a 280nm, este método estima la cantidad de proteína presente en la muestra.
Ventajas:
Método rápido y relativamente sensible.
Limitaciones:
Es incompatible con los métodos de extracción de proteínas que emplean detergentes y/o
agentes desnaturalizantes.
No es un método específico para proteínas, ya que otros compuestos que podría haber en la
muestra también absorben a 280nm (como alcoholes o ácidos nucleicos, entre otros).
Se requiere un sistema puro para poder utilizar este método. (Abyntek, 2023)

Conclusiones
 • La curva de calibración realizada con los datos del grupo 1, tiene una correlación de
0.9933, bastante cercana a 1. Por tanto, se puede concluir que son esos los datos más
confiables para obtener las concentraciones de P1 y P3.
• La muestra P3, se encuentra en una concentración muy por debajo que P1, al punto
que se puede pensar que no hay presencia de proteína en dicha muestra ya que su
valor de absorbancia es muy bajo.

Bilbiografía

(Bioquímica, F. D. (s.f.). DETERMINACION CUANTITATIVA DE LAS PROTEINAS.

Abyntek. (5 de Enero de 2023). Obtenido de https://www.abyntek.com/5-metodos-para-

cuantificar-proteinas/

Altervista. (19 de Septiembre de 2022). Obtenido de https://cellculture.altervista.org/the-

lowry-method-to-quantify-

protein/?lang=es&doing_wp_cron=1684136243.9615280628204345703125