Universidad Tecnológica de Panamá

Facultad de Ciencias y Tecnología

Laboratorio de Bioquímica de Alimentos
Agenda de Laboratorio Virtual
Cuantificación de proteínas en alimentos por los métodos de Biuret y Lowry
(Mayo 24- mayo 28 de 2021)
Profesor(a):
Grupo: 1LI 131 Fecha 2 de junio de 2021
Nombre: Jacqueline Mitre
Nombre Katibel Graell
Nombre: Rubén Ventura

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
Al finalizar la clase, YO podré:
1. ____ Describir los principios en que se basan los métodos de Biuret y Lowry para la
cuantificación de proteínas.
2. ____ Determinar la concentración de proteína de una muestra problema en base a una
curva de calibración desarrollada de datos obtenidos por el método de Biuret.
3. ____ Simular la determinación cuantitativa de proteínas por el método de Lowry.

AGENDA DE TRABAJO

Actividad(es) Pre – sesión Virtual de Laboratorio

Observa los vídeos, accesibles mediante los vínculos de abajo, para que te familiarices con
el procedimiento de medición con un espectrofotómetro y la forma en la que se realiza la
curva de calibración a partir de las absorbancias medidas en un espectrofotómetro y cómo a
través de interpolación se obtiene la concentración de proteínas en la muestra problema
(concentración desconocida).

https://www.youtube.com/watch?v=7PZJGGfbU7U 2.01 min

https://www.youtube.com/watch?v=ZA1lzPMyCMU&t=25s 9.50 min

Responde a las siguientes preguntas:

¿Qué relación debe haber entre la concentración de un analito con su absorbancia para
poder ser medido mediante espectrofotometría?
Relación lineal o directamente proporcional

¿Cuál es la importancia de una curva de calibrado en el análisis de una muestra?

Permite encontrar el valor de concentración de analito a distintas soluciones.

¿Cuáles características indican la calidad de una curva de calibración?

Se deben realizar una cantidad de pruebas próximos a línea promedio para que no se
desvié el valor de R.
Proporcionalidad entre absorbancia y disoluciones.
Actividad(es) Durante Sesión Virtual de Laboratorio en el Horario Asignado
I. INSTRUCCIONES GENERALES
A. Asistencia y discusión de objetivos de la sesión (10min)
B. Discusión de las actividades previas. (15 min)
El estudio del analito mediante espectrofotometría permite encontrar la concentración
del analito en las muestras utilizadas. La curva que se debe presentar para dar resultados
como una gráfica con relación directamente proporcional o lineal. Si algún punto de los
datos obtenido nos da un resultado fuera de esa la línea de tendencia de la función lineal,
entonces la sustancia debe diluirse, nos daremos cuenta porque aparecerá de manera a
una función constante a través de utilizar la solución.
En ausencia del analito se le dice un blanco, el mismo parte de 0 en una gráfica de
calibración. La calidad de esta se presenta a que tan cerca están los valores de la curva
patrón.

II. SIMULACIÓN PRÁCTICA DE LA DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE

PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET. (40 min)

Materiales y Reactivos
1. Tubos de Ensayo
2. Pipetas de 1ml, 5 ml y 10 ml.
3. Propipetas
4. Micropipeta P1000 (100 a 1000 ul)
5. Solución stock de BSA de 20 mg/ml
6. Agua destilada.
7. Reactivo de Biuret
8. Espectrofotómetro.
9. Cubeta de vidrio

Procedimiento
· Se prepara una batería de tubos que incluyan el blanco, el número de tubos de la
curva de

Se prepara una batería de tubos

que incluyan el blanco, el
número de tubos de la curva de
 Describe, apoyado con el internet, el principio de la prueba de Biuret.
 Para un análisis cuantitativo de proteínas comúnmente se prepara el siguiente
conjunto de muestras (estándares y desconocidas) mezclando volúmenes de
componentes en tubos según se indica en la siguiente tabla.

Componente\ Blanco Std.1 Std. 2 Std. 3 Std. 4 Std. 5 Muest. X

Muestra 0 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml 6 mg/ml 8mg/ml 10 mg/ml X mg/ml
BSA* (20 mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0
H2O (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0
Muestra X (mL) 0 0 0 0 0 0 1
Reactivo de Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 4
*BSA= Bovine serum albumin= Albúmina de suero bovino, una proteína utilizada como
estándar.

 Posteriormente, se mezcla bien cada tubo y se dejan reposar por 15 minutos

 Se ajusta la lectura del espectrofotómetro en absorbancia a 540 nm
 Se lee la absorbancia de cada tubo.

Una vez realizada la medición con el espectrofotómetro considera que obtienes los
siguientes valores de absorbancia:

Concentración de BSA Absorbancia Absorbancia corregida

(Abs-blanco)
0 mg/ml 0.074 0
2 mg/ml 0.161 0.087
4 mg/ml 0.255 0.181
6mg/ml 0.340 0.266
8 mg/ml 0.452 0.378
10 mg/ml 0.630 0.556
Muestra X 0.150 0.076

 Construye la curva de calibración con los datos proporcionados en la tabla anterior

y comenta acerca de su calidad.

Absorbancia vs concentración
0.6

0.5
f(x) = 0.0503545454545455 x
R² = 0.990626373268007
Absorbancia (540nm)

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración de BSA (mg/mL)

Grafica 1. Absorbancia vs concentración molar del analito.

Los puntos están en su mayoría debidamente orientados a la linealidad de la función.

Corroborando con el valor de R o el coeficiente de regresión lineal para las
concentraciones trabajadas en la tabla 1, recordando que entre más cerca el valor de R
este de uno hay menor probabilidad de error en los datos obtenidos y mayor veracidad en
que los datos mantengan una forma lineal. Por último, decimos que los datos son muy
próximos entre ellos. También existe un punto específico que se encuentra disperso en la
gráfica que apreciamos, esto señala que pueden existir algunas interferencias, pero que
no es apreciable o no conlleva a gran error. La grafica presenta datos muy satisfactorios y
se permite establecer una buena relación entre los datos que se tienen, ósea que su
calidad es buena.

 Calcula la concentración de proteínas en la muestra X.

Ecuación Lineal obtenida:
 y= 0.0504x
0.076
=X
0.0504
X= 1,507 mg/mL à Concentración de la muestra x

III. SIMULADOR PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL

MÉTODO DE LOWRY. (40 min)

Ingrese al siguiente link para realizar la experiencia virtual.

http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm

Una vez ingrese al link haga clip en la pestaña Lowry para iniciar con el simulador.

Materiales:
 Dos muestras en las que se quiere deteminar la concentración de proteínas
 Disolución patrón de seroalbúmina bovina, 2 g/l (BSA, bovine serum albumin)
 Reactivo C: se prepara mezclando los reactivos A, B1 y B2 en proporciones
100 : 1 : 1 (volumen)
o Reactivo A: Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 M
o Reactivo B1: CuSO4·5H2O al 1% (es decir, 1 g / 100 ml)
o Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 2% (2 g / 100 ml)
 Reactivo de Folin-Ciocalteau diluido 1/4 en agua (componente principal: ácido
fosfomolibdotúngstico)

Preparación del experimento:

Conecta el espectrofotómetro y ajusta la longitud de onda a 580 nm.
Empleando las micropipetas de volumen variable P200 y P1000, prepara en los tubos de
ensayo las mezclas descritas en la tabla
Cuando estén todos completos, añade 2 ml del reactivo C a cada uno de los tubos

y espera para que se desarrolle la primera reacción (10 min virtuales).

Añade 200 µℓ del reactivo de Folin a cada uno de los tubos y espera para
que se desarrolle la segunda reacción (15 min virtuales).
Ejemplo de resultado en un experimento real.
Usa la pipeta Pasteur para transferir el contenido del tubo nº 0 a la cubeta de
espectrofotómetro. Mete la cubeta al especrofotómetro y pulsa el botón “A=0”.
Saca la cubeta y vacíala.
Transfiere con la pipeta Pasteur el contenido del tubo nº 1 a la cubeta, mete ésta al
espectrofotómetro y anota el valor de absorbancia en tu cuaderno de laboratorio.

Puedes pulsar el botón para registrar la lectura de absorbancia en la

pantalla inferior.
Repite el procedimiento para el resto de tubos.
Construye una tabla con la concentración de proteínas en la mezcla de cada tubo

(tubos 0 a 5) y el respectivo valor de absorbancia. Puedes pulsar el botón

para copiar el listado de valores de absorbancia.
Análisis de resultados:
Anota en tu cuaderno de laboratorio el código asignado a tu experimento (en este
caso es 013).
Haz una gráfica representando las absorbancias obtenidas en cada tubo preparado
con proteína patrón (tubos 0 a 5) frente a la concentración de proteína. Si el
comportamiento es lineal, ajusta los datos a una línea recta; si se observa una
curvatura (saturación de la reacción), obtendrás resultados más exactos ajustando
a una polinómica de 2º grado o a una hipérbola rectangular.

Valores de absorbancia obtenidos del simulador:

 A partir de esta recta, calcula:
 la concentración de proteínas en cada uno de los tubos 6 a 9;
Al reemplazar en C=Abs/1.2475 se obtiene que:
Tubo Concentración
⋃6 0.23
⋃7 0.45
⋃8 0.27
⋃9 0.35
⋃10 0.15
⋃11 0.19

 la concentración de proteínas en cada una de las dos muestras de partida (A y B).

Es posible obtener la concentración de partida de las muestras problemas multiplicando

por el factor de dilución de la muestra preparada para ello se usarán las concentraciones
de los tubos 9 y 7, ya que la dilucion es 1:1 se toman estas concentraciones como de
partida para A: 0.7 mg/mL y para B: 0.9 mg/mL

 Discusión grupal de los resultados (20 min)

1. ¿Qué es el reactivo de Biuret y en qué se basa la reacción de Biuret?
El reactivo Biuret es una solución de CuSO4 en solución alcalina NaOH. Se basa en un método
que detecta la presencia de compuestos de tres o más enlaces peptídicos, sirve para la
identificación de todas las proteínas y péptidos cortos. Este
reactivo da un ensayo positivo con los enlaces peptídicos entre
aminoácidos, cuando la solución queda de color violeta. Esto
se debe a que el cobre tiene la propiedad de formar iones
complejos, especialmente entre los enlaces peptídicos.
Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no
los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace
peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los aminoácidos.
2. ¿Cómo seleccionamos el método a utilizar para la determinación de la concentración
de proteínas?
Ambos métodos son factibles, pero el método es de Biuret es más rápido y menos
complicado que el de Lowry. La elección avría según la exactitud que se desee tener o la

3. ¿Cuáles son la limitación de estos métodos para el análisis de proteínas?

El método de Biuret es menos sensible por lo que requiere mas muestras que el de Lowry.
El método de Lowry es algo extenso y complicado y tiene muchas interferencias.

IV. QUIZ DE LA SESIÓN ANTERIOR (15 min)

Actividad(es) post- sesión Virtual de Laboratorio- Trabajo de Grupo

I. PRESENTAR UN INFORME CON LOS DATOS, OBSERVACIONES, RESULTADOS Y
DISCUSIONES DE LA EXPERIENCIA VIRTUAL DE PRUEBAS CUALITATIVAS PARA
AMINOÁCIDOS.