PRÁCTICA DE LABORATORIO #1: CUANTIFICACIÓN EXPERIMENTAL DE

PROTEÍNAS Y AZÚCARES REDUCTORES.

Murcia Valencia Valeria

Pérez Duque Joselyn

Universidad Icesi
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Bioquímica.
Laboratorio de Biocatálisis
Santiago de Cali, Colombia
(10 de septiembre 2022)
valeria.murcia1@u.icesi.edu.co
joselyn.perez1@u.icesi.edu.co

catalítica de esta proteasa, muestran que es

1. Introducción
En la presente práctica de laboratorio se
empleó la técnica de espectrofotometría con
el fin de determinar proteínas totales de una
solución inicial de BSA por el método de
Bradford (se realizó por duplicado, dos
diferentes experimentos) con una longitud
de onda de 595nm; también, se aplicó tal
técnica para la cuantificación de azucares
reductores a partir de disoluciones de
glucosa para el método DNS a 540nm.
Adicionalmente, se evaluó la absorbancia de
dos muestras problema: extracto de levadura
y enzima proteasa.
La Bromelina es una proteasa que se
clasifica, según la IUBMB (International
Union of Biochemistry and Molecular
Biology), como una enzima de clase
hidrolasa. Sin embargo, tal denominación es
genérica ya que se han logrado caracterizar
dos tipos (Lago et al., 1996): la primera, fue
extraída y purificada a partir del tallo de la
planta Ananas comosus, llamada como
“stem bromelain” con número EC 3.4.22.32;
la segunda, está presente en el fruto de la
misma planta, por tal razón es llamada como
“fruit bromelain” con número EC 3.4.22.33.
capaz de hidrolizar proteínas como la
caseína y la hemoglobina a altas tasas.
También, algunos estudios preliminares han
indicado que derivados de Arginina tales
como BAEE (benzoyl-L-arginine ethyl
ester) y BAA (benzoyl-L-argininamide) son
los mejores sustratos para la enzima, entre
otros varios ésteres y amidas (Inagami &
Murachi, 1963). Sin embargo, el ritmo de
hidrolisis del BAEE es moderado
comparado con sustratos como la caseína.
En adición, esta enzima es empleada tanto
en la industria farmacéutica como en la
industria alimenticia. Por un lado, se emplea
para la modulación del crecimiento tumoral,
quemaduras de tercer grado, mejora de la
acción antibiótica y como fármaco para el
tratamiento sistémico oral de enfermedades
inflamatorias (Benucci et al., 2011). Por otro
lado, se utiliza como ablandador de carnes,
en el tratamiento de pescados y otros
productos marinos. Asimismo, en ocasiones
es empleada a nivel de laboratorio con el fin
de fabricar peptonas (que forman parte de
algunos medios de cultivo), aminoácidos y
péptidos y en el estudio de proteínas (Lago
et al., 1996).

Estudios cinéticos, donde evalúan la acción

2. Materiales y método
 extracto de levadura y la enzima proteasa
3. Resultados y discusión por duplicado, de lo que se obtuvo:

Tabla 3 Absorbancia y concentración de

Tabla 1 Concentraciones de solución de proteína para las muestras problema
albumina bovina (BSA)
Extracto de
Concen Enzima proteasa
levadura
tración
de BSA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Absorb Concentr Absorb Concentr
(mg/m ancia a ación ancia a ación
L) 595 nm (mg/mL) 595 nm (mg/mL)
Volume 0,11125 0,13944 0,817 0,72865
n 20 40 60 80
100
solución 0.00 0.0 0.0 0.0 0.0
0.00 Tabla 4 Concentraciones de glucosa para la
BSA 0 0 0 0
(µL) construcción de curva de calibración de
Volume DNS.
n de 80 60 40 20 Concentra
100
agua 0.0 0.0 0.0 0.0 0.00 ción de 0. 0. 0. 0. 1. 1.
0.00 0
destilad 0 0 0 0 glucosa 2 4 6 8 0 4
a (µL) (mg/mL)
Volume Volumen
100 10 10 10 10 100
n total stock de 10 15 20 25 35
0 00 00 00 00 0 0 50
(µL) glucosa 0 0 0 0 0
(µL)
Tabla 2 Resultados de absorbancia Volumen 15
50 45 40 35 30 25
obtenidos de soluciones de albumina con de agua 0
0 0 0 0 0 0
método de Bradford. (µL)
Volumen 50 50 50 50 50 50 50
Muestra total (µL) 0 0 0 0 0 0 0
Concentració Promedi
n (mg/mL) 1 2 o
Tabla 5 Absorbancia de soluciones de
0.2 0.110 0.247 0.1785
glucosa (método de DNS).
0.4 0.469 0.333 0.401
0.6 0.829 0.858 0.843 Concentración Absorbancia
0.8 0.914 0.996 0.955 (mg/mL) obtenida
1.0 0.919 0.955 0.937 0,2 0,102
0,4 0,201
Con el fin de determinar la concentración de 0,6 0,368
proteínas para las muestras problemas,
0,8 0,484
extracto de levadura y enzima proteasa, se
utilizó la función tendencia en la hoja de 1 0,54
cálculo Excel, donde las dos matrices de 1,4 0,872
valores conocidos corresponden a la
concentración de BSA y la absorbancia a
595 nm de las muestras por duplicado de
soluciones de albúmina y la matriz para la
que se hallarán las concentraciones (valor
desconocido) son las absorbancias del
3.1. Datos y cálculos
Figura 1 Curva de determinación total de
proteínas para el Método de Bradford
1,2
Absorbancia a 595 nm
1 y = 1,0355x + 0,0416
0,8 R² = 0,8645
0,6
0,4
0,2
0 volumen alejado a lo requerido.
0 0,2 0,4 0,6 0,8
Concentración de BSA (mg/mL)
Se presenta el promedio de la lectura de
absorbancia a 595 nm por diferentes
concentraciones de BSA en mg/mL para las
muestras 1 y 2.
Según la bibliografía (Novales, 2010), el
coeficiente de determinación, a veces
también denominado como el R-cuadrado,
nos indica el porcentaje de la variación total
en la variable Y (para la practica el eje Y
corresponde a las absorbancias) que la
regresión estimada es capaz de explicar, es
decir, como el porcentaje de la variación de
los valores de la variable dependiente que se
puede explicar con la ecuación de regresión.
De modo que, si se obtiene un coeficiente
próximo a la unidad, significa que el modelo
proporciona un buen ajuste de datos por lo
que se puede emplear con confianza para
efectuar evaluaciones e inferencias acerca
de la situación.
Para la evaluación de proteínas por el
método de Bradford, no se obtuvo un R-
cuadrado lo suficientemente cercano a 1,
comúnmente es aceptable cuando es mayor
o igual a 0,97. Así que, se puede analizar
cuáles aspectos posiblemente condujeron a
obtener tal valor. Se plantean los errores
experimentales y las condiciones del
material empleado durante el ensayo, como
agentes que influyeron en tal medida.
En primera instancia, se le puede atribuir un
valor de R-cuadrado bajo a errores
experimentales debido a que es una medida
obtenida durante la experimentación que se
ve afectada por imprecisiones del desarrollo
del proceso. Un error personal es el
incorrecto uso de la micropipeta, al ser
tantas repeticiones (en total 12 muestras) es
probable que en algún momento no se haya
extraído el volumen indicado, también pudo
ocurrir que se empleara la micropipeta en un
ángulo inferior a 90° durante la aspiración o,
se pudo haber dispensado los reactivos de
manera muy rápida lo que generaría un
1
En segunda instancia, la calidad de las
cubetas es un aspecto imprescindible para
esta técnica ya que es altamente sensible, las
cubetas deben tener una limpieza adecuada
lo que conduce a obtener resultados más
consistentes. Cuando se seleccionaron las 12
celdas para la experimentación se trató de
inspeccionaron y seleccionar aquella que no
estuvieran astilladas, rotas o rayadas. Sin
embargo, la mayoría de las muestras tenían
marcas que pudieron haber obstruido o
intervenido durante el proceso de
absorbancia. Además, algunas habían sido
empleadas por otros grupos previamente así
que para lograr secarlas se tuvo que emplear
un material no tan suave para su limpieza.
Figura 2 Curva de calibración de glucosa
para el método DNS
1
Absorbancia a 540 nm
0,8
y = 0,6291x - 0,0335
0,6 R² = 0,987
0,4
0,2
0
-0,1 0,4 0,9 1,4
Concentración de glucosa (mg/mL)
Se presenta la lectura de absorbancia a 540
nm por diferentes concentraciones de
glucosa en mg/mL.
Se resalta que se obtuvo una correcta
práctica por DNS, es decir, la curva de
calibración obtenida funciona como modelo
para otras experimentaciones. Se llega a la
presente conclusión debido al R-cuadrado
obtenido.
Para el cálculo de la exactitud del Método de
Bradford para cuantificación de proteínas,
se partió de la concentración real de proteína
en el extracto de levadura 0.005-0.010
mg/mL y la de la enzima proteasa 0.2-0.5
mg/mL. Para ello, se usó a la fórmula de
exactitud 𝐸𝑎 = 𝑥̅ − 𝜇, de la que se
obtuvieron los siguientes resultados:
𝐸𝑎 (𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎)
= |0.0075 − 0.13944|
= 0.1319
Que en términos relativos corresponde a:
𝐸𝑎 0.1319
𝐸𝑟 = ∗ 100 = ( ) ∗ 100
𝜇 0.13944
= 94.59%
𝐸𝑎 (𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎) = |0.3500 − 0.72865|
= 0.3787
Que en términos relativos corresponde a:
𝐸𝑎 0.3787
𝐸𝑟 = ∗ 100 = ( ) ∗ 100
𝜇 0.72865
= 51.97%
En consecuencia, se especula que el método
de Bradford usado en la experimentación
alcanzó una exactitud favorable para el
extracto de levadura, pues se obtuvo un
94.59% de exactitud en términos relativos.
No obstante, este no fue el caso para la
proteasa, probablemente por poca experticia
del experimentador y poco tacto cuidadoso
con las muestras e instrumentos de
medición.
Por otro lado, es necesario conocer la
precisión del método para verificar su uso,
por lo que se parte de la ecuación de
desviación estándar:
∑(𝑥 − 𝑥̅ )
𝑠𝑑 = √
(𝑛 − 1)
𝑠𝑑(𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎) = 0.093
𝑠𝑑(𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎) = 0.2677
Con base en esto, se rectifica que para el
extracto de levadura se llevó a cabo una
mejor práctica que para la proteasa. No se
incluye únicamente la experticia o los
errores personales cometidos, sino también
las condiciones ideales para que la reacción
se lleve a cabo. Cabe destacar que la primera
muestra de la proteína se obtuvo una
Absorbancia de 0,455 y en la segunda se
obtuvo 0,360. Se logra analizar que errores
en dos pasos importantes durante el método
de Bradford pudieron haber influido en la
discrepancia de los datos. En primer lugar,
para la segunda muestra de la proteasa, no se
realizó la debida homogenización por
reflujo empleando la micropipeta, aspecto
que puede conducir a extraer solución que
sea “diferente” en comparación a la primera.
En segundo lugar, por temas de errores
personales, es posible que no se haya
esperado el tiempo suficiente para que se
formara el complejo entre el Azul de
Coomasie y las proteínas, lo cual también
afecta la lectura de absorbancia.
3.2 Preguntas de la guía de laboratorio
a) La mayoría de los detergentes
comerciales presentan en su
composición enzimas para la
degradación de proteínas,
carbohidratos y grasas de la ropa
durante la etapa de lavado. ¿Si es
solicitada la medición de proteínas
en una muestra de detergente
ARIEL, que método de
cuantificación utilizaría?
No existe un método ideal para la
cuantificación de proteínas en
solución. Cada método tiene
ventajas y desventajas, de modo que
la elección se basa en la
compatibilidad del ensayo con la
muestra que se desea examinar. Para
muestras, como la de este caso, que
contienen detergentes es común
utilizar métodos basados en la
formación de complejos cobre-
proteína como el método BCA que
no muestra inhibición en presencia
de bajas cantidades de detergentes
(García & Vázquez, s.f.). Este es un
método altamente sensible que
combina la reacción de las proteínas
con Cu+2 en un medio alcalino con
un reactivo para la determinación de
 Cu+ altamente selectivo
denominado ácido bicinconínico.
b) Usted tiene una solución de maltosa
con sacarosa, y desea cuantificar la
concentración total de azúcares
presentes en la muestra. Un amigo le
sugiere utilizar el método del DNS,
¿seguiría la recomendación dada por
su amigo?
Se debe tener en cuenta que la
solución posee dos disacáridos: por
un lado, la maltosa que es un azúcar
reductor, es decir, tiene un grupo
aldehído libre con la capacidad
reductora sobre otra molécula; por
otro lado, la sacarosa es un
disacárido conformado por glucosa y
fructosa, y no logra actuar como
agente reductor. Así que, se
considera poco práctico emplear el
método del DNS para esta situación,
dado que es muy probable obtener
resultados con información
incompleta o totalmente errónea.
Este tratamiento se ha descrito,
específicamente, para la
cuantificación de azucares
reductores donde se determina la
presencia de grupos carbónicos
libres (C=O) de los azucares
reductores. Como conclusión, no se
llevaría a cabo tal técnica
recomendad por el amigo.
4. Conclusiones
• Para el método de Bradford, se
reconoce que es un método útil para
la determinación de proteínas; no
obstante, es importante acotar que es
un método que requiere de cuidado
intenso, ya que se fundamenta en un
colorante sensible a la luz, el azul de
Coomasie G-250, lo que interferiría
en los resultados esperados, como
resultado de la formación errónea del
complejo-proteína.
• A través de métodos como la
regresión lineal fue posible
encontrar la ecuación de la curva de
calibración de azúcares reductores
por el método DNS, y a partir de ello
calcular la concentración
experimental de proteína en las
muestras estudiadas.
5. Referencias
• Benucci, I., Liburdi, K., Garzillo, A.
M. V. & Esti, M. (2011, febrero).
Bromelain from pineapple stem in
alcoholic–acidic buffers for wine
application. Food Chemistry,
124(4), 1349-1353.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.
2010.07.087
• García, H., Vázquez, R. (s.f.).
Cuantificación de proteínas: una
revisión. Instituto de Biotecnología
de UNAM. (pág. 82-85).
cuantificacion-de-proteinas-una-
revision-6052d29f656fc (xdoc.mx)
• Inagami, T. & Murachi, T. (1963,
noviembre). Kinetic Studies of
Bromelain Catalysis*. Biochemistry,
2(6), 1439-1444.
https://doi.org/10.1021/bi00906a04
1
• Lago, I. L., Varela, J. D. & de
Caceres, F. M. (1996, julio). LA
BROMELINA: UNA PROTEASA
DE INTERÉS COMERCIAL.
Ciencia y Tecnologia Alimentaria,
1(2), 17-22.
https://doi.org/10.1080/1135812960
9487552
• Novales, A. (2010, septiembre).
Análisis de Regresión. Universidad
Complutense de Madrid. (pág. 37-
39). 518-2013-11-13-Analisis de
Regresion.pdf (ucm.es)